Sohlh1(Spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix1)，又名Noh(l)h、Gm110、bHLHe80等，是生殖细胞特异表达性转录因子，具有螺旋—环—螺旋结构域，为bHLH(Basic helix-loop-helix)转录因子家族成员之一，通过E-Box(CANNTG)调控下游基因转录，编码Sohlh1基因位于小鼠的第2号染色体及人的第9号染色体上。中国医科大学实验动物部保存有Sohlh1(-/-)小鼠，Sohlh1（-/-）雌鼠的外貌、个体大小与WT雌鼠基本一致，通过肉眼观察无法区分。但成年Sohlh1(-/-)雌鼠不孕，卵巢体积严重减小，只能依靠(♂)Sohlh1(+/-)×♀Sohlh1(+/-)生育保种后代。因成年Sohlh1(-/-)雌鼠卵巢的临床表型与人类卵巢早衰(Prematureovarian failure，POF)患者相似，已有国外学者将Sohlh1列为缺失或突变可导致POF的候选基因。不同国家的研究人员陆续发现人类促卵泡素受体（follicle-stimulating hormone receptor, FSHR）的多种突变，FSHR突变纯合子或杂合子患者的共同临床表现为第一、二性征正常，促性腺激素(Follicle-stimulatinghormone，FSH)水平增高、雌激素(Estradiol，E2)水平降低、卵泡发育受阻、原发或继发性闭经，并伴有卵巢发育不良，是POF的诱因之一。通过启动子突变证实，在FSHR的转录起始位点上游附近存在至关重要的转录调控原件E-box，决定着FSHR的基础转录活性。Sohlh1缺失是否会导致FSHR在小鼠卵巢中表达异常，产生类似POF的临床症状，进而导致雌鼠不孕，尚未有研究证实。　　 进入21世纪以来，越来越多的研究通过基因敲除技术在动物水平证实转录因子在卵泡发生过程中具有不可取代的作用;在转录因子的调控下，数目众多的基因在不同阶段的卵泡发育过程中表达呈现动态变化，对促进卵泡的生成和发育发挥着关键的作用。在小鼠卵巢中，Sohlh1的mRNA最早出现于胚胎期的第13.5天，其蛋白只在卵原细胞簇、原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞中表达，而为什么Sohlh1在次级卵泡及以后阶段卵泡的卵母细胞中彻底消失尚未有文献报道。Yy1条件性敲除雌鼠的发情周期紊乱，血清FSH浓度严重升高且基本检测不到Inhibin-A，生育能力废绝;绝大多数卵母细胞发育停滞于初级卵母细胞阶段，只有单层颗粒细胞包裹;值得关注的是，Sohlh1在Yy1条件性敲除小鼠的卵巢中表达量上调3.79倍，可能是Yy1位于Sohlh1的上游，且抑制Sohlh1表达，但Yy1是否对Sohlh1具有负调控作用，尚未有研究证实。　　 在小鼠精原细胞中，Sohlh1直接正调控Kit转录，进而发挥促进精原细胞分化的作用。哺乳动物卵子发生过程中，卵母细胞与颗粒细胞之间的旁分泌信号传递至关重要。通过多种动物模型研究证实，源于卵泡膜的Kit与源于颗粒细胞的Kit配体（Kitl）之间的相互作用，对于促进腔前卵泡生长、颗粒细胞的增殖具有重要的作用。但在小鼠卵巢中，是否同样存在Sohlh1直接正调控Kit的调控机制，尚未有研究证实。　　 成年Sohlh1(-/-)雌鼠的不孕机制是否和人类POF相似，其FSH、E2血清激素水平及FSHR在卵巢中表达是否异常？在小鼠卵巢中，Sohlh1缺失会导致哪些基因表达出现差异，进而导致卵泡发育障碍;Sohlh1是否如在精原细胞中一样直接调控、激活Kit转录;Sohlh1缺失是否会导致Kit在卵巢中表达异常;Yy1是否对Sohlh1具有负调控作用？上述问题的答案尚未揭晓。本课题从生理、组织、分子等多水平着手，探讨Sohlh1(-/-)雌鼠的不孕机制。　　 材料与方法:　　 一、实验材料　　 （一）SPF级C57BL/6J雌鼠及Sohlh1(-/-)雌鼠　　 （二）石蜡切片、免疫组化及TUNEL细胞凋亡原位检测相关试剂　　 （三）电镜检测相关试剂　　 （四）酶联免疫吸附测定(ELISA)相关试剂　　 （五）基因芯片相关试剂　　 （六）双荧光素酶报告基因相关试剂　　 （七）染色质免疫沉淀(ChIP)相关试剂　　 二、实验方法　　 （一）Sohlh1基因敲除小鼠基因型的鉴定　　 利用突变型和野生型两对引物，分别以小鼠鼠尾DNA为模版进行PCR扩增。　　 （二）Sohlh1基因敲除小鼠卵巢石蜡切片H.E染色、免疫组化及TUNEL细胞凋亡原位检测　　 手术摘取8w WT、Sohlh1（-/-）小鼠卵巢，于Bouins固定液中固定。卵巢经水洗、乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片，H.E染色、免疫组化及TUNEL细胞凋亡原位检测等步骤，在显微镜下观察卵巢组织结构、FSHR及凋亡细胞在卵巢组织中的分布。　　 （三）电镜样本制作　　 手术摘取12w WT及Sohlh1(-/-)雌鼠卵巢，迅速放入2.5％戊二醛溶液中固定2h，经PBS冲洗，于1％锇酸中固定2h。经生理盐水清洗后，使用50％、70％乙醇和80％、90％丙酮脱水。Epon812包埋、切片、染色，透射电镜下观察并拍照。　　 （四）小鼠血清FSH及E2浓度的检测　　 提取8w WT及Sohlh1(-/-)雌鼠血清，利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中FSH及E2的浓度。　　 （五）基因芯片检测　　 使用Trizol提取3只8w Sohlh1(-/-)雌鼠(KO1，KO2，KO3)与3只8w WT雌鼠(WT1，WT2，WT3)的卵巢组织RNA，利用美国Affymetrix公司小鼠表达谱基因芯片筛查获得差异表达基因。　　 （六）实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测　　 提取8w Sohlh1(-/-)雌鼠与8w WT雌鼠卵巢RNA，利用Real-time PCR方法对基因芯片筛查获得的部分差异表达基因进行验证。　　 （七）双荧光素酶报告基因检测　　 将pcDNA3.0-Sohlh1表达质粒分别与FSHR启动子荧光素酶表达质粒pGL3-FSHR-X和海肾荧光素酶表达质粒pRL-TK共转染293T细胞，进行启动子转录活性分析。将pcDNA3.0-Sohlh1表达质粒分别与Kit启动子荧光素酶表达质粒pGL3-Kit-X和海肾荧光素酶表达质粒pRL-TK共转染293T细胞，进行启动子转录活性分析。将pcDNA3.1-Yy1表达质粒分别与Sohlh1启动子荧光素酶表达质粒pGL3-Sohlh1-X和海肾荧光素酶表达质粒pRL-TK共转染293T细胞，进行启动子转录活性分析。　　 （八）染色质免疫沉淀(ChIP)　　 8w WT雌鼠卵巢经甲醛固定，SDS细胞裂解、超声剪切基因组DNA、交联蛋白/DNA的免疫沉淀反应、Protein/DNA复合体的洗脱、解交联释放DNA、DNA纯化、PCR扩增特异结合位点，研究转录因子是否结合于特异位点。　　 （九）统计分析　　 数据使用GraphPad Prism5 software进行统计分析，以p＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果:　　 一、小鼠卵巢形态、组织学观察结果　　 成年Sohlh1(-/-)雌鼠卵巢体积严重减小，无卵泡结构，卵泡发育受阻。在成年Sohlh1(-/-)雌鼠卵巢中，FSHR并未表达缺失。成年Sohlh1(-/-)雌鼠卵巢中布满棕色的凋亡细胞。　　 二、透射电镜观察结果　　 在成年Sohlh1(-/-)雌鼠卵巢卵母细胞细胞质中，线粒体受损且数量明显减少，表现为线粒体膜破裂、线粒体嵴部分缺失。　　 三、小鼠血清FSH及E2浓度的检测结果　　 成年Sohlh1(-/-)雌鼠与WT雌鼠血清FSH和E2浓度无显著差异。　　 四、Sohlh1基因敲除小鼠卵巢差异表达基因筛查结果　　 在成年雌鼠卵巢中，Sohlh1缺失可导致2788个基因表达出现差异，通过聚类分析发现其中包括86种凋亡相关基因、15种TGF-β信号通路相关基因、67种配子发生及生殖细胞特异相关基因。Real-time PCR验证部分基因差异表达结果，与基因芯片结果基本一致，验证了基因芯片结果的准确性。　　 五、双荧光素酶报告基因实验结果　　 Yy1对Sohlh1启动子-2335bp～+42bp区域有负调控作用;Sohlh1对Kit启动子-2298bp～+124bp区域有正调控作用;Sohlh1对FSHR启动子-1876bp～+119bp区域的转录活性有负调控作用。　　 六、染色质免疫沉淀(ChIP)结果　　 在成年小鼠卵巢中，转录因子Yy1结合于Sohlh1转录起始位点上游-2087bp～-2079bp(GACCATCAC)区域，证明在体内Yy1与Sohlh1启动子特异结合;证实Sohlh1结合于小鼠卵巢Nlrp5启动子上的-1146～-1141bp(CACGTG);Nlrp14启动子上的-417～-412bp(CAGCTG)等位点的E-Box，但未证实Sohlh1结合于Kit启动子。　　 结论:　　 1、成年Sohlh1(-/-)雌鼠与人类POF患者的不孕机理并不完全相同。虽然成年Sohlh1(-/-)小鼠卵巢体积严重减小、卵泡发育受阻，但成年Sohlh1(-/-)与WT雌鼠血清FSH和E2的浓度无显著差异，且在成年Sohlh1(-/-)小鼠卵巢中FSHR并未表达缺失。Sohlh1缺失后导致成年小鼠卵巢细胞广泛、大量凋亡，卵母细胞线粒体受损且数量明显减少，进而导致卵泡发育受阻，才是Sohlh1（-/-）雌鼠不孕的原因。　　 2、在成年小鼠卵巢中，Sohlh1为抗凋亡因子，其缺失可导致2788个基因表达出现差异，其中包括86个凋亡相关基因、15个TGF-β信号通路相关基因、67个配子发生及生殖细胞特异相关基因。　　 3、在成年小鼠卵巢中，Yy1与Sohlh1启动子特异结合，对Sohlh1具有负调控作用;Sohlh1与Nlrp5、Nlrp14启动子特异结合。虽然Sohlh1对Kit启动子的转录活性具有正调控的作用，但在成年小鼠卵巢中未证实Sohlh1结合于Kit启动子。