背景由于先天性或者后天性腹壁缺损而导致的腹壁疝是外科医生常常需要面临的问题,当前美国每年因各种疝而需要行手术治疗的患者大约在990,000人次,相比传统的缝合修复,无张力修补技术可以获得更为满意的术后效果,并且使用补片进行疝的修复可以减少大约50%-75%的疝复发。为了达到更满意的治疗效果,无张力补片修复技术被越来越多的外科医生所采用,目前无张力修补技术被认为是疝修复的金标准,并已经逐步取代传统的缝合修补技术。这导致了补片制造行业的加速发展,目前在美国市场上大约有超过200种以上的补片类型,全球每年大约有100万张补片应用于疝的修复上。目前临床上应用的补片类型主要包括合成高分子材料以及脱细胞生物材料,脱细胞生物材料主要包括动物来源以及人尸来源,猪小肠粘膜现作为一种可再生材料被广泛应用于临床和临床前的研究,其主要作用是能够帮助修复机体因外界损伤而导致的缺损,其修复机体缺损的主要机制是诱导干细胞向移植缺损区迁移,并且诱导干细胞分化成缺损区域的细胞,从而达到自体重塑的效果,同时也避免了人造高分子材料移植后引起的慢性炎症所导致的一系列的并发症。尽管再生材料在缺损修复上面的作用非常强大,但是也有其自身的缺陷,包括急性炎症反应、血清肿、可能携带病原菌(供体动物自身所带病原菌)等,但是产生的这些后果的主要原因均和脱细胞的不彻底密切相关,其中包括生物材料中含有的细胞膜成分,相应的长链DNA片段等,这些和脱细胞的方式以及脱细胞所使用的脱细胞试剂明确相关,因此探索一种新型的,优化的,可取的脱细胞方式尤为重要。研究目的脱细胞的细胞外基质生物支架是近年来研究和应用的热点,然而由于脱细胞操作步骤繁琐,脱细胞程度受限,以及“过度”脱细胞等原因,脱细胞生物材料未能大量地运用于临床,本课题选用猪小肠粘膜下层作为研究对象,采用物理机械刮除方式作为对照,分别使用震荡和灌注两种方式进行脱细胞,并比较二种不同脱细胞方式所制得生物补片的脱细胞程度、生物力学变化以及残留生物活性因子等,为探索一种更优化、更可取的脱细胞方式奠定理论基础。研究方法(1)两种制作脱细胞生物基质的基本步骤及评估手段:1、猪小肠粘膜下层的准备:6月大的小猪4只(由上海柯惠临床试验基地提供),雌雄各2只,体重约100kg,屠宰后取新鲜猪小肠,仅选空肠作为实验材料。间断取材后,采用单纯的机械刮除方式制备U-SIS作为对照,用0.1%过氧乙酸/4%乙醇震荡脱细胞方式制备S-SIS,用0.1%过氧乙酸/4%乙醇灌注脱细胞方法制备P-SIS,制备完成的材料进行-120℃24 h冻干密封后,环氧乙烷消毒,-80℃保存;2、脱细胞程度评估及细胞外基质的微观三维结构观察:通过检测三种脱细胞材料的DNA含量,HE染色镜检及电镜扫描来评估细胞外基质的脱细胞程度及微观结构;3、生物力学评估:将三种材料分别进行胀破力、拉断力以及透湿性检测;4、生物活性因子含量评估:比较三种材料的VEGF、TGF-β、b-FGF生物活性因子的含量。(2)灌注脱细胞的机理研究:将片状的猪小肠粘膜下层,连接于生物反应器上(附图1、2),分别检测压力渗透作用以及流水冲洗作用单独对猪小肠粘膜下层的脱细胞效果。1、压力渗透对SIS脱细胞效果的影响:将片状SIS平铺在反应器上,两边反应器使用螺母旋紧,避免灌注过程中脱细胞溶液流出。用0.1%过氧乙酸/4%乙醇试剂制备细胞外基质(灌注过程中检测灌注侧压力变化),剪取中心区域SIS,-120℃24 h冻干密封后,环氧乙烷消毒,检测DNA含量,评估脱细胞程度。2、流水冲洗对SIS脱细胞效果的影响:将片状SIS平铺在反应器上,两边反应器使用螺母旋紧,避免灌注时脱细胞溶液流出,0.1%过氧乙酸/4%乙醇试剂制备细胞外基质(两边同时灌注,且灌注过程中,维持两侧压力相似),剪取中心区域SIS,-120℃24 h冻干密封后,环氧乙烷消毒,提取DNA,评估脱细胞程度。结果(1)脱细胞程度比较:U-SIS组、S-SIS组、P-SIS组的DNA含量分别为13766.49±1628.32 ng/mg,4856.578±151.17 ng/mg,2009.712±242.50 ng/mg;结果显示猪小肠粘膜下层脱细胞后DNA含量均明显下降,均与对照组DNA含量差异有统计学意义(P<0.05),其中以灌注脱细胞法制得的P-SIS脱细胞程度最高,其DNA含量为震荡方式的1/2,两者之间差异有统计学意义(P=0.000);(2)生物力学比较:U-SIS组、S-SIS组、P-SIS组拉断力分别为4.43±0.3 N/cm,3.43±0.3 N/cm,3.82±0.5 N/cm,与对照组相比,脱细胞后的猪小肠粘膜下层拉断力均有所下降,且两组拉断力下降程度和对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),U-SIS组、S-SIS组、P-SIS组的透湿性分别为19680±3614.53 g/㎡d,33792±5036.80 g/㎡d,33398.4±6491.25 g/㎡d;经过脱细胞处理的SIS其透湿性较对照组相比明显升高,差异存在统计学意义(P<0.05),但S-SIS组和P-SIS组之间的透湿性差异无统计学意义(P=0.904),P-SIS组拉断力较S-SIS组稍大,但差异无统计学意义(P=0.173);U-SIS组、S-SIS组、P-SIS组的胀破力分别为23.54±1.93 psi,17.34±1.36 psi,23.62±1.92 psi,S-SIS组的胀破力与U-SIS、P-SIS组相比差异均存在统计学意义(P<0.05),P-SIS组胀破力较U-SIS组有少量升高,但两组间差异无统计学意义(P=0.944)。(3)生物因子含量比较:U-SIS组、S-SIS组、P-SIS组的b-FGF含量分别为7.45±0.77pg/mg,4.44±0.60 pg/mg,5.34±0.40 pg/mg;与对照组相比,S-SIS组、P-SIS组的b-FGF含量均有所下降,和对照组相比,差异有统计学意义异(P<0.05),P-SIS组的b-FGF含量较S-SIS组高,差异具有统计学意义(P=0.037),U-SIS组、S-SIS组、P-SIS组的TGF-β含量分别为:10.47±0.29pg/mg,4.71±0.80 pg/mg,9.28±0.59 pg/mg;脱细胞后的细胞外基质的TGF-β较对照组均有所下降,其含量与U-SIS组相比,差异有统计学意义(P<0.05),P-SIS组TGF-β含量较S-SIS组含量高,差异具有统计学差异(P=0.021);U-SIS组、S-SIS组、P-SIS组的VEGF含量分别为70.50±1.33pg/mg,11.29±0.13 pg/mg,22.74±1.37 pg/mg,与对照组相比,S-SIS组、P-SIS组的VEGF均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05),并且S-SIS下降程度尤为明显,P-SIS组VEGF含量为S-SIS组两倍,差异且具有统计学意义(P=0.000)。H&E染色结果:U-SIS上存在着较多细胞,依附于细胞基质表面,而S-SIS、P-SIS基质上的细胞明显减少,S-SIS中胶原蛋白之间结构较松散,P-SIS中丝状纤维之间结构紧密。电镜扫描可以看出:U-SIS表面覆盖有较多细胞及细胞碎片,但是基质纤维之间结构紧密,S-SIS表面细胞数明显减少,但仍然可见少量细胞碎片,但基质胶原蛋白之间结构松散,P-SIS表面无明显组织碎片,基质蛋白纤维之间紧密程度较高。(2)灌注脱细胞机制研究:1、压力渗透组NDA含量为:2629.63±52.74 ng/mg,流水冲洗组DNA含量为:2773.16±74.71 ng/mg,压力渗透组制得的细胞外基质DNA含量较流水冲洗组少,差异具有统计学意义(P=0.028),压力渗透组及流水冲洗组两组基质DNA含量均高于灌注组,差异具有统计学意义(P<0.05)结论针对于目前广为使用的震荡脱细胞制取细胞外基质,本实验研发了一种新的脱细胞方式,1、避免了振荡过程片状的ECM因纠结而导致材料不能得到全部的、彻底的脱细胞处理的结果;避免震荡脱细胞过程中的不断更换脱细胞试剂,存在细菌的交叉污染,导致脱细胞支架的内毒素等不能达标的结果;避免震荡脱细胞过程中操作的非机械化,导致操作过程中(如更换试剂等)需要大量的人力物力的结果;2、新的脱细胞方式在保留细胞外基质完整超微结构的基础上较震荡脱细胞具有更良好的脱细胞结果;3、新的脱细胞方式在生物力学上和震荡脱细胞无明显差异,部分力学(胀破力)较震荡脱细胞方式提高;4、新的脱细胞方式在干重相同情况下保留了更多的生物活性因子含量,为组织重塑提供了更好的依据;5、灌注脱细胞的机制是由SIS的渗透以及冲刷作用共同作用的结果。以上结果显示,灌注脱细胞方式为一种新型的,优化的,可取的脱细胞方式;为制作高生物活性、高机械强度的生物材料提供了更好发展方向。