澳大利亚Macquaie大学的Marc Wilkins于1994年首次提出蛋白质组(proteome)一词,其含义是指在某一个整体中所表达的全套蛋白质,可以是某个基因组,某个细胞或组织,某个生物个体等。蛋白质组学即是利用高通量、高灵敏度的技术手段系统研究生物体系内的蛋白质及其活动规律的新兴学科,主要内容包括蛋白质鉴定、翻译后修饰、蛋白质功能确定等诸多方面,尤其是近年来在肿瘤细胞增殖、分化和形成等方面研究更为热门,从而为肿瘤的早期诊断、新药物靶点的发现、治疗效果评价和治疗后效果评判等提供了重要的理论依据。组蛋白是真核生物细胞核中与DNA结合存在的碱性蛋白,其乙酰化的失衡与癌症发生之间存在着密切的联系。已有文献报道,组蛋白H3的乙酰化水平在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肾癌等疾病中具有重要的临床诊断意义,如预测肿瘤复发,判断肿瘤相关表型,评价预后因素与患者预后表现。原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤,其病死率在全世界所有癌症中排在第3位。在中国,肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占原发性肝癌的90%,但迄今为止,还未见组蛋白H3乙酰化位点及水平在HCC中的研究报道。定量蛋白质组学在生理和病理研究中的地位愈趋重要。基于质谱的定量蛋白组学领域中,同位素标记相对其他技术有着高效,高精度和高序列覆盖度的特点,但是昂贵的同位素试剂以及复杂的标记技术限制了它的应用。本部分研究中,我们把一个相对廉价的酯化反应应用于组蛋白H3乙酰化的定量。甲基化标记发生在氨基酸的酸性基团(Asp和Glu)和C端上,使标记位点产生3.0188 Da的质量差异,良好的线性和重复性表明甲基化反应能够很好的与LTQ-Orbitrap技术联用。本论文中通过色谱分离,甲基化定量与LTQ-Orbitrap技术联用,分别对正常肝细胞L02和非转移肝癌细胞HepG2,肝癌转移细胞97H和非转移肝癌细胞HepG2,高转移潜能细胞LM3和低转移潜能细胞97L的组蛋白H3乙酰化修饰位点进行定量分析,通过选取定量比值大于2或小于0.5的乙酰化肽段作为发生变化的肽段,结果获得了10个乙酰化以及甲基化修饰肽段的定量信息。HepG2相比于L02中组蛋白H3后修饰的位点,有50%的肽段含量发生了显著下降,97H相比于HepG2中组蛋白H3后修饰的位点,鉴定到的10条肽段中,有8条肽段的含量都明显的降低了,而对于高转移潜能的肝癌细胞LM3相比于低转移潜能的肝癌细胞97L来说,有6条肽段的含量明显降低。另外,在五组细胞系中,都首次鉴定到了组蛋白H3的异构体H13.3的乙酰化肽段K*SAPSTGGVK(“*”代表乙酰化修饰位点)。该方法可以被应用到组蛋白翻译后修饰的研究和定量分析中,该结果为肝癌及其它癌症中组蛋白翻译后修饰的深入研究提供了更多的信息。高效的富集方法是大规模鉴定乙酰化修饰中必不可少的一步。传统乙酰化蛋白鉴定的方法无法得到具体的乙酰化修饰位点信息,仅能检测到其存在,比如放射性实验和免疫亲和检测。将乙酰化的富集技术与质谱的鉴定技术结合也是乙酰化研究中的主流方法,不但能检测到乙酰化翻译后修饰蛋白,而且能得到具体的乙酰化修饰位点信息,而利用抗赖氨酸乙酰化抗体进行乙酰化修饰的富集是目前主要的富集方法。微流控芯片因其分析速度快、高通量、样品损耗小、成本低等优点,在蛋白质组学分析研究中得到了广泛的应用,并日益显示出其优越的性能。在众多的微流控芯片材料中,聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)应用较为广泛,得益于它可以和泵系统连用实现化学反应和生物过程与微芯片分析一体化。但由于PDMS的疏水性,使其容易非特异性吸附细胞、细菌、蛋白质等物质,从而影响芯片的生物分析效能。同时这种聚合物表面能量低,缺乏活性基团进行功能化反应,因此在使用PDMS制作功能化的细胞芯片时,需要对材料表面进行活性基团的修饰改性。近年来,随着蛋白质分离富集技术的发展,大量的乙酰化蛋白及位点已经被鉴定到,为其功能研究提供更多的信息。由于乙酰化蛋白在细胞中的含量很低,在鉴定中其信号会被大量的非乙酰化蛋白所抑制,这给乙酰化蛋白质的鉴定及功能研究带来了很大的挑战。在本研究工作中,首次将微流控芯片与Protein A/G定向化固定抗体的优势结合在一起,通过Protein A/G在自制的微流控芯片中固定乙酰化抗体,对乙酰化蛋白及乙酰化肽段进行富集,并用MALDI-MS对富集的乙酰化蛋白及其乙酰化位点进行鉴定。研究结果显示Protein A/G可以与抗体的恒定区域特异性的结合,不但可以很好的保持抗体的活性,而且可以极大的提高抗原的结合效率和特异性,该方法对于乙酰化蛋白的富集效率可达到82.4%,并且相比富集前,经过富集后,在质谱图中我们可以得到更多的乙酰化肽段信息,此方法反应条件温和,操作简单,并具有很好的重复性,为乙酰化蛋白的富集鉴定开辟了一条新的途径。本部分工作通过改变芯片表面的疏水性,使其具有亲水性表面及良好的生物活性,然后通过正负电性将Protein A/G Beads固定于芯片表面上。其主要优势在于：1)抗体的固定方向不是随机的,Protein A/G可以与抗体的恒定区域Fc特异性的结合,既能很好的保持抗体可变区Fab与抗原结合特异性,又可以提高与抗原的结合活性和结合效率；2)使用微流控芯片通过Protein A/G固定抗体,可以有效的减少抗体和抗原的用量,且可以达到很好的检测效果；3)反应条件温和,步骤简单,这对于实验的时间、成本都是一种节省。研究中将我们将芯片固定抗体方法和常用免疫沉淀的方法进行了比较。使用芯片固定抗体富集乙酰化蛋白,需用样品量少而且富集效率远远高于传统的免疫沉淀法。免疫沉淀(immunoprecipitation, IP)主要用于抗原或者抗体的定性及半定量检测,是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象而开发出来的分离抗原的免疫学方法。常用的免疫沉淀的方法即为琼脂糖小珠法。该方法能对抗原进行高效富集,通过离心法分离得到抗原-抗体复合物,并通过进一步的洗脱、鉴定等步骤,获得目标蛋白并分析其性质。但从体系中分离小珠的唯一方法是高速离心,比较繁琐费时,且离心后吸取并弃去上清的过程中,难以保证沉淀下来的小珠不损失。使用芯片固定抗体富集乙酰化蛋白,需用样品量少而且富集效率远远高于传统的免疫沉淀法。我们新建立的方法可以很好的规避这些缺点,节约了检测时间,同时也提高了检测效率,这种方法值得在更多的蛋白质研究中进行推广。