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背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种滑膜细胞炎性增生、血管翳形成并侵蚀破坏软骨和骨的自身免疫性疾病。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是RA病变关节中血管翳和软骨连接处最常见的细胞类型。FLS通过产生细胞因子、趋化因子和基质降解分子,迁移至关节软骨处并侵蚀软骨和骨,导致受累关节组织结构破坏,引起关节功能障碍。在白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-17、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等炎性因子的激发下,RA-FLS表达核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)增多,RANKL与破骨细胞前体细胞表面的核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)特异结合,促进破骨细胞前体细胞的发育分化及成熟破骨细胞的活性,最终引起关节骨质侵蚀破坏。早期诊断、早期联合改善病情抗风湿药物(DMARDs)治疗对有效控制RA患者受累关节骨破坏、降低疾病活动度、减少病情反复发作至关重要。甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)是风湿病学界公认的RA治疗的首选药物,大部分RA患者对以MTX为基础的联合治疗反应良好,但仍有约1/3的患者对目前常用的联合治疗方案疗效反应差,仍需探讨新的有效的联合治疗方案。本课题组前期临床研究显示,疾病活动期的RA患者对环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)小剂量与MTX联合治疗疗效明确,且安全性较好。动物实验研究结果表明,CTX联合MTX可抑制胶原诱导性关节炎动物模型中炎性细胞因子的产生,调控树突状细胞、调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)的数量和功能,恢复致炎与抗炎细胞之间的平衡。本研究采用体外实验,旨在探讨CTX的体外活性形式——4-过氧氢环磷酰胺(4-hydroperoxy cyclophosphamide,4-H-CTX)联合MTX对RA-FLS表达RANKL的抑制作用,以及两者联合作用的信号转导机制。目的:探讨CTX联合MTX对RA-FLS表达RANKL的抑制作用以及两者联合作用的信号转导机制。采用体外实验的方法,应用IL-6与可溶性IL-6受体(sIL-6R)复合物刺激RA-FLS活化,检测RA-FLS细胞RANKL的表达水平,并分析CTX、MTX以及两者联合应用对IL-6/sIL-6R介导的RANKL表达的影响;探讨JAK2/STAT3和p38MAPK信号通路在IL-6/s IL-6R介导的RA-FLS上调表达RANKL中的作用,并分析CTX联合MTX是否通过JAK2/STAT3和p38MAPK信号通路抑制了RANKL的表达。方法:获取6例确诊的活动期RA患者的膝关节滑膜组织,建立RA-FLS体外细胞培养体系,细胞培养至第4~6代用于实验研究。本研究分为两部分。第一部分:环磷酰胺联合甲氨蝶呤抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中IL-6/sIL-6R介导的RANKL表达上调应用IL-6/sIL-6R复合物刺激RA-FLS活化,检测RA-FLS细胞RANKL的表达水平,并分析CTX、MTX以及两者联合应用对IL-6/sIL-6R激发的RANKL表达的抑制作用。(1)应用流式细胞术和光镜下观察细胞形态对所培养的RA-FLS进行鉴定;(2)不同浓度的IL-6/sIL-6R复合物对RA-FLS表达RANKL的影响:应用不同浓度的IL-6/sIL-6R(0,10,25,50,100,200 ng/ml)与RA-FLS共同培养,检测RANKL表达水平,明确IL-6/sIL-6R刺激RA-FLS活化并表达RANKL的作用,并探讨实验最适合的IL-6/sIL-6R刺激浓度;(3)确定合适的CTX、MTX孵育浓度,应用MTT法分析该孵育浓度对RA-FLS细胞活性的影响;(4)CTX、MTX以及两者联合应用对RA-FLS表达RANKL的影响:实验分为5组(空白对照组、IL-6/sIL-6R阳性对照组、CTX组、MTX组、CTX联合MTX组),应用蛋白印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和细胞免疫荧光观察CTX联合MTX对RANKL表达的抑制作用。第二部分:环磷酰胺联合甲氨蝶呤调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞RANKL表达的信号转导通路机制研究探讨IL-6/sIL-6R介导的RA-FLS上调表达RANKL是否通过JAK2/STAT3和/或p38MAPK信号通路,以及CTX联合MTX是否通过JAK2/STAT3和/或p38MAPK信号通路抑制了RANKL在RA-FLS的表达。(1)JAK2/STAT3和p38MAPK信号通路是否调控RA-FLS中IL-6/sIL-6R诱导的RANKL表达上调:实验分为4组(空白对照组、IL-6/sIL-6R阳性对照组、JAK2/STAT3抑制剂AG490组、p38MAPK抑制剂SB203580组),应用蛋白印迹法观察信号通路抑制剂对RANKL以及信号转导蛋白STAT3、p38及其磷酸化蛋白的调控作用。(2)CTX以及MTX对信号转导蛋白的调控作用:实验分为5组(空白对照组、IL-6/sIL-6R阳性对照组、CTX组、MTX组、CTX联合MTX组),应用基于细胞的酶联免疫吸附实验(cell-based ELISA)方法检测信号转导蛋白STAT3、p38及其磷酸化形式p-STAT3、p-p38的表达水平,并同时检测RANKL的表达,分析CTX以及MTX对信号转导蛋白表达的调控作用,阐明CTX联合MTX抑制RA-FLS中RANKL表达的信号转导机制。结果:(1)本课题研究所建立的RA-FLS体外培养方法可靠,光镜下表现为典型的梭形细胞,形态均匀;流式直方图结果显示,钙黏附蛋白-11的荧光强度明显高于同型对照,而CD14、HLA-DR抗原的荧光强度与同型对照没有差异,提示所培养的滑膜细胞表达FLS特异性黏附分子——钙黏附蛋白-11,而滑膜巨噬细胞标记分子CD14和HLA-DR表达阴性。结果说明,所培养的滑膜细胞经传代后,已基本去除了滑膜巨噬细胞,纯化为均一性较好的FLS。(2)不同的IL-6/sIL-6R孵育浓度及不同孵育时间的实验结果表明,IL-6/sIL-6R孵育浓度为100 ng/ml时,RANKL mRNA的表达水平最高;RA-FLS与IL-6/sIL-6R共同孵育培养至72~96 h,RANKL mRNA的高水平表达维持在比较稳定的状态。MTT实验结果表明,4-H-CTX(1μg/ml)和/或MTX(100 nM)与RA-FLS共培养,在孵育时间为72 h时对RA-FLS细胞活力无明显影响。故采用上述的药物浓度及孵育时间进行后续实验。(3)IL-6/sIL-6R复合物可介导RA-FLS表达RANKL增多。与空白对照组相比,IL-6/sIL-6R组的RANKL m RNA表达增多,RANKL蛋白合成增加;细胞免疫荧光分析显示,IL-6/sIL-6R组FLS中的绿色荧光较空白对照组明显增强;上述结果提示,给予IL-6/sIL-6R刺激后,FLS的RANKL表达明显增加。(4)实时荧光定量PCR检测结果显示,给予CTX和/或MTX干预后,RANKL mRNA的表达明显降低,与IL-6/s IL-6R组比较差异有统计学意义(P<0.01);OPG mRNA的表达较IL-6/sIL-6R组增高,差异有统计学意义(P<0.05)。CTX+MTX联合用药组RANKL mRNA的表达较CTX及MTX单用药组均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),OPG mRNA的表达较MTX单用药组增高,差异有统计学意义(P<0.05)。析因设计的方差分析结果显示,CTX和MTX对RANKL mRNA表达的影响有交互作用(F=33.932,P<0.001),两者联合应用可协同抑制RA-FLS表达RANKL mRNA。蛋白印迹法结果表明,CTX或MTX干预后,RANKL蛋白的表达水平有降低趋势;CTX+MTX联合用药组RANKL蛋白的表达较IL-6/sIL-6R组显著下降,差异有统计学意义(P<0.01),同时,联合用药组RANKL蛋白的表达低于CTX或MTX单用药组(P<0.05)。CTX和/或MTX干预后,OPG蛋白的表达较IL-6/sIL-6R组增高,但仅联合用药组OPG蛋白的表达与IL-6/sIL-6R组差异有统计学意义(P<0.05)。析因设计的方差分析结果显示,CTX和MTX可协同抑制RANKL蛋白的表达,两药联合应用存在交互作用(F=16.265,P<0.001)。细胞免疫荧光分析结果显示,给予药物干预后,CTX组、MTX组、CTX+MTX联合组的荧光明显减弱,其中,CTX+MTX联合组的荧光强度最低。(5)胞内信号转导机制的研究结果表明,IL-6/sIL-6R可增加FLS中信号蛋白STAT3和p38的磷酸化水平,即p-STAT3和p-p38蛋白表达增加,同时RANKL蛋白的表达也明显上调(P均<0.01)。给予通路抑制剂AG490、SB203580后,p-STAT3、p-p38蛋白表达下降,同时RANKL表达下调(P均<0.01)。Cell-based ELISA方法分析结果显示,IL-6/sIL-6R复合物刺激可上调增加FLS中信号蛋白p-STAT3和p-p38表达,同时RANKL蛋白的表达也明显上调,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。给予CTX或MTX干预后,p-STAT3和p-p38蛋白表达水平较IL-6/sIL-6R组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05),同时,RANKL的表达降低(P<0.01),且CTX+MTX联合组的抑制作用最强。析因设计的方差分析结果显示,CTX和MTX对RANKL和p-STAT3蛋白表达的影响有交互作用(F=57.871,P<0.001;F=16.477,P=0.001),两药联合应用可协同降低RANKL和p-STAT3蛋白的表达。对磷酸化p38表达的抑制作用以CTX最为显著(F=43.602,P<0.001)。结论:(1)IL-6/sIL-6R复合物可诱导RA-FLS上调表达RANKL;(2)CTX以及MTX均可抑制RA-FLS中IL-6/sIL-6R介导的RANKL表达;(3)IL-6/sIL-6R复合物刺激RA-FLS上调表达RANKL过程中需要STAT3和p38MAPK信号蛋白磷酸化活化;(4)CTX联合MTX通过调控JAK2/STAT3和p38MAPK信号通路,进而抑制RA-FLS中IL-6/sIL-6R介导的RANKL表达上调。(5)CTX和MTX可协同抑制RANKL和p-STAT3的表达,对p-p38表达的抑制作用以CTX作用最显著。