目前植物转基因的操作过程中普遍采用抗卡那霉素基因,抗草丁膦基因,抗潮霉素基因等抗性标记基因,将其与目标基因一起导入植物,可以通过抗性来筛选转基因植株,减少了工作量。然而,在获得转基因植株之后,标记基因就不再起任何作用,反而会带来诸多问题。人们已经在标记基因的删除方面做过许多研究工作,但到目前为止还缺乏一种高效、可控、易用的删除选择标记基因的方法。本研究的主要目的就是提供一种高效的删除转基因植物选择标记基因的方法。利用Cre-loxP定位重组系统,构建了pHIMES系列载体,运用其转化烟草和拟南芥并分析其在删除转基因植物选择抗性基因方面的有效性,取得以下研究结果。　　 为了去除Cre基因在细菌中的本底表达对载体构建和植物转化的影响,本研究首先构建了一个含有植物内含子的Cre基因。将来自蓖麻过氧化氢酶基因的mCBC内含子插入Cre重组酶基因中,得到iCre基因。RT-PCR和测序结果表明,在过表达iCre基因的转基因烟草中mCBC内含子3’末端的6个碱基TTACAG未被剪切掉,而是滞留在iCre基因的成熟mRNA中,即mCBC内含子发生了不完全剪切。等位基因特异PCR分析发现,在过表达iCre基因的转基因烟草的根、茎和叶组织以及过表达iCre基因以及含有mCBC内含子的Gus基因的拟南芥叶片中,mCBC内含子都发生了不完全剪切。不完全剪切对Cre重组酶的活性产生很大影响,其介导的重组率由野生型的64％降为23%。通过点突变,分别得到iCre2和iCre3基因。等位基因特异PCR分析表明,iCre2基因和iCre3基因在拟南芥叶片中都发生了完全剪切,这为后续研究奠定了良好的基础。　　 利用iCre2基因,构建了pHIMES系列载体。这一系列载体的T-DNA区中构建了热激启动子hsp驱动下的iCre2基因的表达框,选择抗性基因的表达框,驱动目的基因表达的启动子、供目的基因插入的多克隆位点以及目的基因下游的终止子。其中iCre2基因和选择抗性基因的表达框位于两个同向的loxP位点之间。运用这一系列载体转化植物后,对转基因植物进行热激处理,就可得到不含选择抗性基因,只含有目的基因的转基因植物。这一系列载体具有不同的驱动目的基因的启动子和不同的选择抗性基因,适于转化多种植物。实验证明这一系列载体在大肠杆菌和农杆菌中不会发生重组。　　 利用pHIMES系列中的pHIMES-35B载体,以Gus基因作为目的基因,转化野生型烟草,对3株单拷贝转基因植株的叶片进行热激和分化处理,通过PCR检测发现,再生后代中发生选择标记基因删除的比例分别为90%、70%和79%。对照实验发现,在未经热激处理的转基因植株叶片直接分化产生的再生后代中,也可检测到低水平的选择标记基因删除事件,比例约为5%-10%。对3株多拷贝转基因植株进行热激和分化处理,发现再生后代植株的目的基因拷贝数也有不同程度的降低。此外,本研究还探索了对得到的marker-free转基因植株进行再转化的可行性,克隆了拟南芥调控花色素代谢途径的MYB转录因子基因PAPI,将其作为目的基因对热激处理后得到的marker-free转基因植株进行二次转化,得到20株再转化的转基因阳性植株,证明再转化的可行性。　　 利用pHIMES35B-GUS载体转化拟南芥,得到10株转基因拟南芥T1代植株。对T2代种子的筛选实验正在进行中,计划对纯合的T3代单拷贝转基因拟南芥种子进行热激,通过抗性筛选确定热激后选择标记基因的删除率,并验证该系统在转基因拟南芥中的有效性。　　 综上,本研究提供了一种热激诱导的选择标记基因删除系统,在转基因烟草和拟南芥中验证了该系统的有效性;构建了两个含有植物内含子的Cre重组酶基因,iCre2和iCre3,这在植物基因工程研究方面具有重要意义。此外,本研究深入探讨了mCBC内含子的不完全剪切现象,并强调了在利用内含子改造基因序列时,对插入其中的内含子进行严谨的剪切分析的必要性。