细胞内活性物质的分布、变化及相互作用的探究,对于了解细胞内复杂多变的生理生化过程具有十分重要的意义。荧光技术的不断发展,为探究细胞内复杂多变的过程提供了技术手段。过氧化物酶体作为真核细胞中一种重要的细胞器,尚缺乏能够准确定位其中的荧光探针用以研究其功能。近年来,蛋白质特异性标记技术结合了荧光蛋白和小分子荧光探针的优势被开发应用,SNAP-tag凭借对靶蛋白标记所具有的高特异性和稳定性以及配体功能的多样性等独特优势在众多靶向标记技术中脱颖而出。本文以SNAP-tag蛋白标记技术为基础,利用新型荧光底物对过氧化物酶体进行标记,并同时对NO进行实时监测,为定位监测小分子活性物质在细胞内的分布、变化及功能的探究提供技术手段。基于此,本论文主要做了以下工作：(1)采用基因工程方法,构建原核表达载体pET28a-SNAP,通过原核表达纯化获得SNAP-tag蛋白(约27 kD),浓度为2.14 mg·mL-1。利用新型荧光底物TMR-BG、 BDP-BG标记SNAP-tag蛋白,光谱结果显示,与对照组(使用BSA蛋白)相比,加入SNAP-tag蛋白的实验组荧光显著增强,且荧光强度随时间的延长而不断增强直至平衡。证明新型荧光底物与SNAP-tag蛋白可以实现高效、特异性的结合,为后续细胞内标记实验的可行性奠定基础。(2)构建pSNAP-PTS1/pCLIP -PTS1真核表达载体。稳定转染至COS-7细胞中,实现SNAP-tag及CLIP-t ag蛋白在过氧化物酶体中的表达。TMR-BG、BDP-BG对SNAP-tag的标记结果及BDP-V-B C对CLIP-tag的标记结果显示,三种荧光底物均能对相应细胞内的特定位点进行荧光标记,标记的位置呈现球形或椭圆形分布于细胞质中,而不含有PTS1信号肽的pSNAP/pCLIP呈现整个细胞的分散标记。初步判断实现了对细胞内过氧化物酶体的标记。构建pEGFP-PTS1真核表达载体,瞬时转染至稳定表达SNAP-PTS1的细胞中,与TMR-BG荧光底物的共成像结果显示重叠效果良好,验证pSNAP-PTS1特异性表达于过氧化物酶体中并实现了对过氧化物酶体的标记。此外,实现了TMR-BG与BDP-B G对过氧化物酶体的双色荧光标记。(3)应用能够检测NO的SNAP-tag荧光底物TMR-NO-BG,实现了对过氧化物酶体标记的同时实时监测NO。综上所述,本研究重组表达了SNAP-tag蛋白,结合新型荧光底物实现了对过氧化物酶体的荧光标记,并对NO进行了实时监测。