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口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)引起的牛、猪、羊和野生偶蹄动物的一种急性高度接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病之首。口蹄疫病毒是小RNA病毒科(Picornaviridae)、口疮病毒属(Aphthovirus)的代表性成员,有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia1 7个血清型。已有的研究证明,FMDV至少有五种细胞识别机制,即细胞表面的整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8和硫酸乙酰肝素可作为FMDV的受体。本试验从OA/58株FMDV感染康复猪的舌皮和肺组织中提取总mRNA,根据GenBank中已发表的不同动物的整联蛋白αv、β1、β6亚基基因序列,设计引物,利用RT-PCR技术扩增αv、β1、β6亚基基因,通过将产物与pGEM-T Easy载体连接,构建重组克隆载体pGEM-αv、pGEM-β1、pGEM-β6并进行序列测定。基因测序结果表明,本试验所获得的新基因核苷酸序列和所编码氨基酸的序列与GenBank中收录的相对应牛整联蛋白基因一致性较高,都达到90%以上。根据基因测序结果,分别重新设计并合成原核表达引物,以重组质粒pGEM-αv、pGEM-β1、pGEM-β6为模板,进行PCR扩增各亚基配体结合域(LBD)基因片段。然后将αvLBD扩增产物与pPROExHTb质粒连接,β1LBD、β6LBD的扩增产物分别与pGEX-4T-1质粒连接,构建了重组原核表达载体pPRO-αvLBD、pGEX-β1LBD、pGEX-β6LBD,将其分别转化到BL21(DE3)宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,所表达的目的蛋白大部分以包涵体形式存在。将各包涵体纯化,并分别免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。SDS-PAGE分析表明,上述各基因片段在大肠杆菌中成功获得了表达,αvLBD分子量大小为40000左右,GST -β1LBD、GST-β6LBD分子量均为42000左右,与预期的大小相吻合。ELISA和Western Blot分析表明兔抗αvLBD、β1LBD、β6LBD的效价都达到了1:12800以上,具有较高的特异性。根据pGEM-β6开放阅读框(ORF)两侧序列,设计并合成真核表达引物,以pGEM-β6为模板,进行PCR扩增β6基因片段,将扩增产物与pCDNA3.1/(+)载体连接,构建了重组真核表达载体pCDNA3.1/(+)β6,并转染表达人αv亚基的结肠癌细胞株SW480,检测αvβ6整联蛋白的表达。间接免疫荧光抗体结果显示,转染细胞在细胞可表达整联蛋白β6亚基,而SW480细胞和pCDNA3.1/(+)空载体转染细胞未检测到β6亚基的表达。