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目的缺血性骨坏死目前已成为一种常见病,尤其是股骨头坏死致残率最高。目前对该病的认识有了很大的提高,但其发病机制尚未完全明了,除已知创伤等病因外,其余病因和发病机理复杂而不明确。对其发生机制国内外学者进行了基础和临床研究,提出了各种学说,从不同的侧面阐述了各自的观点。尽管非创伤性股骨头坏死的病理机制仍不清楚,但与创伤性股骨头坏死的病理改变十分相似,认为均由于局部缺血后,骨及骨髓成分出现坏死。以细胞学及分子生物学为基础来阐述其病理改变有助于对非创伤性股骨头坏死病理机制的了解。缺血是凋亡的常见诱导因素之一,目前脑缺血诱导神经细胞凋亡方面的文献较多,在缺血性损伤研究中,心、肝、肾等脏器的细胞死亡亦与细胞凋亡有关,但缺血后骨组织是否存在凋亡国内外未见报导,了解局部缺血后骨组织内细胞凋亡情况,探明缺血性骨坏死的发病机制具有重要意义。本实验通过建立缺血性骨坏死的动物模型及观察由于股骨颈骨折行人工关节置换时取出的股骨头,检测骨组织中是否存在细胞凋亡及缺血时间与凋亡程度的关系,并在此基础上进一步观察Bcl-2、Bax免疫反应阳性细胞与凋亡细胞的相关性,旨在探讨Bcl-2,Bax对缺血性骨组织细胞凋亡的调控作用。从细胞学和分子生物学方面探讨缺血性骨坏死的发病机制。材料和方法1.实验对象及处理因素SD大鼠35只,雄性,体重280～300g(由中国医科大学实验动物部提供)。2%戊巴比妥钠25mg/kg腹腔注射麻醉,手术在无菌条件下进行,左侧髋部为手术侧,右侧为对照侧,切开左侧关节囊,切断股骨头圆韧节,使髋关节脱位,于大粗隆下20mm处截断股骨,剥离软组织,而后放置股骨近端于原位,缝合皮肤,不做内外固定。分别于术后3h、6h、12h、24h、72h各处死7只,取出两侧股骨近端,4%多聚甲醛固定,20%EDTA(PH7.4),4℃脱钙2-3周,以针刺法检查至脱钙完全,而后石腊包埋。临床收集21例股骨颈骨折需行人工关节置换术患者的股骨头。病例均来自中国医大一院骨科,男6例,女15例,年龄:62-83岁,取材时距骨折的时间3天-3周。将股骨头沿冠状面剖开,切成厚约5mm骨片,4%多聚甲醛固定24h,20%EDTA(PH7.4),4℃脱钙3-4周,每3天更换脱钙液,以针刺法检查至脱钙完全,而后石腊包埋。2.试剂来源:凋亡检测试剂盒及兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、Bax单克隆抗体及生物素化抗地高辛抗体IgG均购自武汉博士德生物工程有限公司。3.观察指标:①HE染色;②透射电镜观察;③DNA凝胶电泳(琼脂糖凝胶电泳分析DNA断裂);④末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记[Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)dUTP nick end labeling,TUNEL]法检测凋亡细胞;⑤免疫组化检测Bcl-2、Bax表达;⑥计算机显微图像分析系统(型号:MetaMorph/DP10/BX41,生产厂:UIC/OLYMPUS/US/JP)处理,x~2检验和t检验,统计学分析。结果1.动物实验部分HE染色形态学改变:缺血3h,6h骨小梁内骨细胞及成骨细胞形态未见明显改变,缺血12h:骨髓内细胞可见变性坏死,部分骨细胞坏死,缺血24h:成骨细胞消失,缺血72h:可见软骨细胞坏死。(2)透射电镜:缺血12h及24h,细胞固缩,染色质浓聚裂解,胞浆内小泡及凋亡小体形成,细胞核可见边集现象。(3)琼脂糖凝胶电泳:本实验缺血12h、24h标本提取DNA后,经琼脂糖凝胶电泳检测可见到相同的“梯状”条带,梯状条带是凋亡细胞DNA片段化(fragmentation)的结果,内源性核酸内切酶(endonuclease)将核小体间的连接DNA降解,形成长度为180～200bp整数倍的寡核苷酸片段,组蛋白和其它核内蛋白质不降解,核基质也不改变,由于大部分细胞凋亡出现DNA梯状条带,而细胞坏死时DNA随意断裂为长度不一的片段,琼脂凝糖胶电泳呈“弥散状”(Smear)。本实验中缺血72h即可见“弥散状”条带。(4)TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)测定:缺血6h、12h、24h组均可检测到TUNEL阳性骨细胞,并与缺血3h、72h组对照,χ~2检验,有显著性差异(p＜0.01)。缺血3h可见Bcl-2及Bax阳性表达,缺血6h时Bcl-2/Bax增高,缺血12h,24h时Bcl-2/Bax下降,缺血72h时,Bcl-2及Bax均呈弱阳性表达。2.临床研究部分DNA凝胶电泳可见特征性“梯状”(ladder)条带,骨小梁骨细胞及骨髓细胞均有TUNEL检测阳性细胞,统计学分析凋亡细胞与Bax表达,t检验有相关性(p＜0.01)。结论1.大鼠股骨头缺血后骨小梁内可检测出骨细胞凋亡,细胞凋亡是缺血性骨坏死早期骨细胞死亡的途径之一。2.Bcl-2、Bax可能参与了缺血性骨坏死早期病理过程中细胞凋亡的调控。3.Bcl-2/Bax比值与骨细胞凋亡程度相关。4.股骨颈骨折后股骨头因缺血可出现骨小梁内骨细胞凋亡,且与Bax基因表达有相关性。