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大肠杆菌是人和动物肠道的条件致病菌,大肠杆菌病是一类多发性、致死性肠道传染病。内毒素为革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖(LPS),是病原对宿主造成损害的最主要致病因子之一,主要通过激活TLR4信号转导通路诱导TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子大量产生,引起宿主炎性应答反应。本实验室前期研究表明金英黄归汤对金黄色葡萄球菌具有良好抑菌作用,对奶牛隐性乳房炎具有一定的临床疗效。本研究从临床分离1株大肠杆菌,并对大肠杆菌的LPS进行提取、纯化及活性分析,以小鼠乳腺上皮细胞(MECs)为体外细胞模型,研究金英黄归汤对LPS介导细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)表达的影响。主要研究内容如下:1.猪源大肠杆菌的分离鉴定及金英黄归汤对其体外抑菌试验:采集贵阳市某猪场有腹泻症状的仔猪粪便与肠道内容物,对分离菌进行形态学、生理生化、16SrDNA鉴定及致病性观察;采用试管法和平板法测定金英黄归汤对分离菌株的体外抑菌作用。结果表明,分离菌在普通琼脂培养基上呈光滑、灰白、湿润、圆形、边缘整齐、稍有隆起的菌落;在麦康凯培养基上呈圆形、红色、边缘整齐的菌落;在伊红美蓝培养基上形成黑色带金属光泽的菌落。染色镜检见G-中等大小杆菌,生化试验符合大肠杆菌的生化特性,PCR扩增出16S rDNA约1 466 bp片段,测序结果与GenBank中大肠杆菌序列进行比对同源性达99%以上;分离株对小鼠的致死率达83%(5/6);从腹泻病料中分离获得1株致病性猪源大肠杆菌。金英黄归汤对分离菌株的最小抑菌浓度(MIC)为31.25 mg/mL,最低杀菌浓度(MBC)为62.5 mg/mL。2.猪源大肠杆菌脂多糖提取、纯化及活性分析:采用热酚水法提取分离株细菌LPS,通过DNaseⅠ、RNaseA、蛋白酶K和醇沉法对LPS进行纯化,通过苯酚硫酸法、Bradford法和紫外分光光度法测定LPS多糖、蛋白及核酸含量,鲎试剂定量法测定其活性,采用急性毒性试验方法测定小鼠半数致死量(LD50)。结果表明,提取纯化的猪源大肠杆菌LPS平均产率为3.74%,多糖含量为13.40%,蛋白含量为0.48%,核酸含量为0.06%,提取的LPS属于光滑型LPS(S-LPS),活性为1.21×107 EU/mg,对小鼠LD50为31.86 mg/kg。3.金英黄归汤对LPS介导小鼠MECs分泌TNF-α、IL-6、IL-1β的影响:通过混合酶消化法获取小鼠MECs,以小鼠MECs为体外细胞模型,采用MTT法测定LPS刺激小鼠MECs的最佳浓度,ELISA法检测金英黄归汤对LPS介导小鼠MECs分泌促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的影响。结果表明,成功获得纯度高的小鼠MECs,LPS刺激小鼠MECs最适浓度为8μg/m L,金英黄归汤低、中、高剂量组(40、400、4000μg/mL)均能显著或极显著(P<0.05,P<0.01)抑制LPS介导小鼠MECs TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌。结论:本试验成功分离到一株猪源大肠杆菌,金英黄归汤对其具有较好的抑菌作用;对该株大肠杆菌提取的LPS纯度高、产率高及毒力强。混合酶消化法能在短期内分离到大量的乳腺上皮细胞,且细胞纯度达到98%,金英黄归汤对LPS介导小鼠MECs分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β有显著抑制作用。