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维生素D3（VD3）是一类脂溶性维生素,作为重要的激素前体,具有广泛的生理活性。VD3母核结构中若C1或C25发生羟基化,可形成活性VD3,相应的生理活性显著提高,是体内VD3发挥生理作用的基本形式。利用选择性羟化酶实现活性VD3的生物转化具有反应条件温和,立体专一性好,环境友好等优势,具有很好的工业化前景。VD3羟化酶来源广泛,包括假诺卡氏菌、浅灰链霉菌及哺乳动物体内的CYP450羟化酶,其中部分已成功在大肠杆菌中实现了活性表达。本文围绕生物转化法合成活性VD3的工艺路线展开,根据文献查阅,分别克隆表达了来源于自养无支酸菌（Pseudonocardia autotrophica）中VD3羟化酶（Vdh）及其偶合效率较高的的氧化还原酶FdR及氧化还原蛋白Fdx。通过酶的纯化及体外电子传递效率的研究证实以上三种蛋白被活性表达,进一步建立了以VD3为底物催化合成25（OH）VD3反应体系,初步探索了一菌多酶体系中辅酶循环对转化效率的影响,具体研究内容如下:通过文献查阅,人工合成了Pseudonocardia autotrophica菌中的VD3羟化酶Vdh基因,构建了表达载体pET28b-vdh。作为细胞色素CYP450单加氧酶家族成员,Vdh酶对VD3进行选择性羟化过程需要辅酶NADH或NADPH作为电子供体,而电子传递的过程中需要氧化还蛋白及氧化还原酶组分作为电子传递链,通过级联的氧化还原过程完成对底物VD3的选择性羟化。通过文献参阅,我们选择了与Vdh偶联效率较高的铁氧还原蛋白酶FdR与铁氧还原蛋白Fdx,并利用核糖体结合序列rbs实现了两个基因的串联表达,构建了重组质粒pET28b-Fdr-Fdx。随后分别对大肠杆菌基因工程菌pET28b-Vdh、pET28b-Fdr-Fdx进行了诱导表达条件的优化,获得Vdh与FdR-Fdx的最佳诱导条件:最佳诱导温度分别为20、24℃,诱导剂为IPTG及添加量分别为0.25、0.5 mM,诱导OD值为0.60,诱导时间为12 h。研究了羟化酶Vdh及其电子传递链FdR-Fdx的生物学功能。基于CYP450酶的结构特性,通过CO差光谱法验证了Vdh的酶在还原状态下具有450 nm的特异吸收峰,证实其亚铁血红素结构域被正确折叠。此外,在电子传递链功能研究中,利用DCPIP为人工电子受体证实FdR具有还原活性,并进一步利用细胞色素C作为电子受体证实Fdx能够与Fd R进行偶联。通过与还原型的Vdh羟化酶在450 nm吸收波长进行比较,证明了电子传递链FdR-Fdx能够选择性地接收辅酶NADH的电子进行传递,并与Vdh酶的羟化反应产生偶联作用,以上结果证实羟化酶Vdh及其电子传递链FdR-Fdx在大肠杆菌细胞中实现了活性表达。以VD3为底物,考查了Vdh与Fdr-Fdx粗酶液催化合成25（OH）VD3的最佳反应条件:催化反应温度为30℃,催化反应pH为7.5,催化反应时间为12 h,底物浓度为100μM,缓冲液中含160 mM乙酸钠,80 mM葡萄糖,100 mM NaCl,最佳萃取剂为乙酸乙酯,VD3的最高转化率达到了18.21%。为进一步提高底物VD3的转化率,尝试构建一菌三酶的催化体系提高Vdh酶的可溶性表达及辅酶NADH的利用率,在100μM底物浓度下,通过变换质粒pET32b、p ET20b,将VD3的转化率提高到了21.11%。此外,尝试通过偶联葡萄糖脱氢酶（GDH）,形成辅酶NADH的循环系统,构建了pCDFDuet-Vdh-GDH与pET28b-FdR-Fdx的双质粒共表达体系,12 h内,VD3转化率提高至27.31%。