钙敏感受体（Calcium-sensing Receptor,CaSR）是C族G蛋白偶联受体（GPCRs）的成员之一,CaSR在人体内广泛分布,参与众多的生理病理过程,主要通过监控胞外Ca²⁺的浓度和响应多种信号刺激,进而调节机体的Ca²⁺稳态。CaSR是同源二聚体,每个单体是由N端胞外结构域（ECD）、七次跨膜结构域（7TM）和胞内C末端结构域（C-tail）三部分组成。ECD区是配体结合的主要区域,能够结合多种配体,如多价阳离子(Ca²⁺、Gd³⁺、Mg²⁺)、精胺和L-氨基酸等,其中Ca²⁺是CaSR的主要激动剂。CaSR的7TM存在别构调节剂的结合位点。已有研究表明,CaSR的7TM可能同时存在多种天然配体的结合位点,在C族GPCRs中,这种现象是极少出现的。而对于A族GPCRs而言,由于不含有ECD区,因此其配体结合位点位于7TM。可以看到缺失ECD区的CaSR突变体表现出类似A族GPCRs特点。据统计,具有组成型活性的野生型GPCRs主要集中在A族。并有研究表明,具有组成型活性的C族受体代谢型谷氨酸受体（mGluR5a）在去除ECD只保留7TM的情况下,依然能够组成型激活G蛋白,揭示了其具有组成型活性的结构基础是7TM。此外,GPCRs各家族发现的大量组成型激活突变也主要集中在7TM结构域。提示缺失ECD区的CaSR突变体可能具有组成型活性。已知包括野生型CaSR在内的大多数C族GPCRs是没有组成型活性的,也并未见其缺失ECD区的突变体组成型活性的相关报道。CaSR的7TM是否具有的组成型活性,以及7TM在CaSR感受胞外信号、调节下游信号中的作用均有待进一步阐明。本研究首先构建了N端带有mGluR5信号肽的ECD缺失的突变体ΔCaSR以及ECD和C-tail同时缺失的ΔCaSRΔ两种截短突变体。利用酶联免疫吸附试验和免疫荧光的方法,证实两种突变体在HEK293细胞中表达情况与野生型CaSR相似,并且均能正常上膜。在不加PAM,单独用Ca²⁺、Mg²⁺和精胺天然配体刺激时,分析胞内钙信号及1-磷酸肌醇（IP1）的生成量,结果显示发现ΔCaSRΔ和ΔCaSR均能响应胞外Ca²⁺刺激,同时ΔCaSRΔ对精胺也有一定的响应。这些研究结果有力证实CaSR的7TM存在Ca²⁺结合位点。为探究ECD区缺失的CaSR突变体是否具有组成型激活现象,本论文对IP1积累量以及本底胞外信号调控激酶（ERK1/2）激活情况进行了检测,发现两种突变体均没有检测到本底IP1的积累,因此均不能组成型激活G_q信号;但是与野生型CaSR相比,两种突变体均可显著促进本底ERK1/2的活化,并且本底ERK1/2的激活可以被CaSR特异的别构调节剂调控。这一结果表明,在ECD缺失时,CaSR的7TM结构域能够组成型激活ERK1/2。据报道,CaSR能够通过多种G蛋白依赖或非依赖的信号途径促进ERK1/2的活化。为进一步探究突变体组成型激活ERK1/2的分子机制,本论文在ΔCaSRΔ中分别引入两个突变位点F801A和L797A,干扰受体与G_q、G_i/o蛋白的偶联。实验结果显示这两个位点的突变均不影响ΔCaSRΔ组成型激活ERK1/2,表明缺失ECD区的突变体可能以一种G_q和G_i/o非依赖的方式偏好性地激活ERK1/2。综上所述,本论文证实胞外Ca²⁺能够不依赖PAM的存在单独激活ECD区缺失的CaSR突变体,有力证实了CaSR的7TM结构域存在Ca²⁺结合位点;并且首次发现ECD缺失的CaSR突变体能够组成型激活ERK1/2信号通路,这一现象可能是通过G_q、G_i/o蛋白非依赖性的偏好性信号途径介导。这些研究结果为探究7T在CaSR信号跨膜转导过程中的作用奠定了基础,深化了当前对CaSR结构及其激活机制的认知。同时为C族无组成型活性GPCRs结构与功能的研究提供了新思路。