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冬凌草甲素(oridonin)是一种从冬凌草中提取出的二萜类活性物质,具有消炎、抗菌、抗肿瘤等多种药理学活性,因为其抗肿瘤活性而获得了广泛的关注。Copine1由CPNE1基因编码,是一种钙离子磷脂结合蛋白。作为copines家族成员之一,Copine1具有多种生物学功能,有研究发现其对于肿瘤细胞的发生具有重要作用。首先,本课题使用CCK-8试剂盒检测发现oridonin能够有效抑制肝癌细胞SMMC7721的增殖,且抑制作用具有浓度、时间依赖性;制作免疫荧光爬片,将其置于激光共聚焦显微镜下观察,发现oridonin作用后能够明显观察到SMMC7721细胞内自噬泡的形成,western blot结果也验证了oridonin诱导的细胞自噬;AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒染色,流式细胞术检测到oridonin处理后的SMMC7721细胞的凋亡率明显提高,表明oridonin诱导了 SMMC7721细胞产生细胞凋亡;细胞周期分析发现oridonin能够使SMMC7721细胞的细胞周期停滞于G2/M期。随后,利用基于细胞培养条件下稳定同位素标记(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)的差异蛋白组学技术鉴定oridonin作用前后,SMMC7721细胞内总蛋白质表达变化的情况。按照蛋白质表达变化倍数大于1.3或者低于0.77,我们鉴定到经oridonin作用后,SMMC7721细胞中表达上调的蛋白质85个,表达下调的蛋白质206个。进一步使用生物信息学对差异蛋白的生物学功能、亚细胞定位、相互作用网络等进行了分析。最后,通过对差异蛋白组学数据的分析,我们发现copine1蛋白在oridonin作用后发生明显上调;为了进一步探究copine1蛋白在oridonin作用SMMC7721细胞过程中的生物学功能,我们使用小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)干扰CPNE1基因表达,发现干扰copine1蛋白表达能够增强oridonin对SMMC7721细胞的增殖抑制作用;干扰copine1蛋白表达能够增强oridonin诱导SMMC7721细胞的细胞自噬及细胞凋亡作用,其中,细胞凋亡作用的增强可能与copine1下调后泛素化结合蛋白p62的过量表达有关。本课题初步探讨了copine1蛋白与oridonin诱导SMMC7721细胞的细胞自噬和细胞凋亡的关系。结果表明copine1蛋白能够延缓oridonin诱导的细胞自噬及细胞凋亡,其延缓作用与copine1调控泛素化结合蛋白p62蛋白的表达有关,并且该延缓作用增强了SMMC7721细胞对oridonin的耐药性。本课题为进一步探索oridonin抗肿瘤的分子机理以及研究copine1蛋白的生物学功能奠定了基础。