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前列腺癌是欧美国家男性发病率最高的恶性肿瘤。随着我国人口老龄化加剧,生活习惯的西化,我国成年男性前列腺癌的发病率与死亡率呈逐年上升的趋势,成为危险中国男性健康的主要疾病之一。近年来,非编码RNA特别是以miRNA及lncRNA为代表在前列腺癌进展及转移当中的作用已经得到了广泛的研究,然而miRNA与lncRNA之间的交叉调控作为肿瘤恶性进展中另一个重要议题在前列腺癌中的作用并未系统性的研究。HOTAIR是一个在多种肿瘤中均显著高表达,并促进肿瘤的进展的癌基因。最新研究表明HOTAIR在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)中高表达,能直接作用于雄激素受体(AR)并促进前列腺癌的增殖与侵袭。而HOTAIR通过招募多梳抑制复合物2(polycomb repressor complex 2,PRC2)调节染色质的状态及甲基化水平是其参与肿瘤进展的另一重要机制,而HOTAIR与miRNA的相互调控网络参与前列腺癌进展未见系统性报道。本课题组前期分析了激素依赖性前列腺癌(ADPC)与CRPC组织的miRNA差异表达谱,筛选出CRPC组织中低表达的miRNAs;另一方面,结合GEO数据库(GSE26996)我们进一步筛选出在前列腺癌细胞系中能被PRC2的催化亚基EZH2负调控的miRNAs;再利用miRcode、DIANA TOOLS、starBase v2.0等生物学网站找到与HOTAIR有靶向关系的miRNAs群。将三者miRNAs群交叉发现16个miRNAs中,进一步分析发现miR-193a-3p(miR-193a)在转移性前列腺癌显著低表达,然而其在前列腺癌中的表达水平及生物学功能尚未见报道。基于这样的研究现状,本研究首先通过分析数据库验证miR-193a的表达水平,并通过体内外实验探讨EZH2/miR-193a轴在前列腺癌中的生物学功能。利用分子生物学实验探讨HOTAIR联合EZH2表观沉默miR-193a的分子机制。最后通过生物信息学及荧光素酶报告基因实验验证miR-193a靶向负调控HOTAIR的表达。本研究拟探讨HOTAIR/EZH2/miR-193a环路在前列腺癌进展中发挥的分子机制,为前列腺癌的早期筛查及靶向治疗提供坚实的理论依据。在第一部分中,我们对MSKCC(GSE21032)及TCGA数据库资料的二次分析表明,miR-193a在转移前列腺癌中的表达低于非转移前列腺癌,在T3-4临床分期的前列腺癌中的表达低于T1-2分期前列腺癌。原位杂交显示,miR-193a在Gleason<7、Gleason=7及Gleason>7的前列腺癌组织中表达水平依次降低。在去势抵抗性前列腺癌细胞系中(PC3和DU145),通过干预EZH2和miR-193a的表达量(过表达或敲低),利用CCK-8和低密度细胞集落形成实验验证EZH2/miR-193a轴前列腺癌细胞增殖能力的影响。结果发现过表达EZH2能够促进细胞的增殖能力,而在此基础上同时过表达miR-193a,EZH2的促进增殖作用显著受抑制;而在前列腺癌细胞系中敲低EZH2,细胞增殖活性明显降低,而在此基础上同时抑制miR-193a的表达,细胞的增殖活性得到部分恢复。通过在PC3细胞中过表达miR-193a后,提取细胞总RNA,测序获得全转录组,并通过基因探针富集分析(GSEA)发现细胞有丝分裂及G2/M细胞周期检查点两个基因簇呈现负向富集。流式细胞仪术及TUNEL实验检测细胞凋亡水平,发现过表达EZH2前列腺癌细胞凋亡与NC组无明显差异,而在此基础上同时过表达miR-193a细胞凋亡明显增加;另一方面敲低EZH2,前列腺癌细胞凋亡率明显增加,而在此基础上同时抑制miR-193a的表达,细胞的凋亡率明显降低。在Transwell小室实验中,过表达miR-193a能抑制PC3和DU145细胞的迁移及侵袭的能力。GSEA分析提示miR-193a过表达后,促进前列腺癌转移相关的TGF-β、TNF-α/NF-kB及KRAS信号通路基因簇呈现负向富集。裸鼠皮下成瘤实验表明,过表达miR-193a表达组的细胞瘤体大小和体积明显小于对照组,同时在皮下移植瘤体的病理切片中,免疫组化实验结果表明细胞增殖相关基因Ki-67、血管生成影响因子CD31、CD34的表达均显著降低。以上体内外实验结果证实miR-193a在前列腺癌中发挥抑癌基因的作用,并能部分逆转癌基因EZH2的功能。MiR-193a在前列腺癌中的表达及功能虽然已经被阐明,但miR-193a在前列腺癌中的表达调控机制仍不十分明确。第二部分中,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测干预EZH2及HOTAIR水平后miR-193a的表达,结果表明敲低EZH2后miR-193a在PC-3和DU145细胞中的表达量增高,而过表达EZH2后PC-3及DU145细胞中miR-193a表达量降低。然而PC3和DU145即使在过表达EZH2后,敲低HOTAIR仍能使miR-193a的表达量上调,提示HOTAIR在EZH2上游调控miR-193a的表达。Western Blotting提示在PC3和DU145细胞系中敲低EZH2后H3K27me3表达水平明显下降,过表达EZH2后H3K27me3表达升高,而敲低HOTAIR后EZH2和H3K27me3表达水平均下降。我们进一步构建miR-193a启动子的报告基因质粒,通过荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验验证了HOTAIR招募EZH2诱导miR-193a启动子区的H3K27的三甲基化从而沉默其表达。第三部分中,qRT-PCR检测过表达miR-193a的前列腺癌细胞系或PC3瘤体中HOTAIR表达水平,结果表明miR-193a能抑制前列腺癌细胞系及瘤体中HOTAIR的表达。进一步的荧光素酶报告基因实验表明miR-193a能与HOTAIR靶向结合。我们选取31例临床前列腺癌组织,利用免疫组化技术检测切片中EZH2的表达,原位杂交技术检测HOTAIR与miR-193a分子的表达,量化统计结果分析发现miR-193a的表达与HOTAIR的表达呈负相关,miR-193a的表达也与EZH2的表达呈负相关(P<0.001)。由此我们证明在前列腺癌细胞中,miR-193a能靶向负调控HOTAIR的表达。结合三部分的实验结果,HOTAIR能招募EZH2表观沉默抑癌基因miR-193a的表达。而HOTAIR作为miR-193a的直接靶基因,miR-193a的表观沉默释放了miR-193a对HOTAIR表达的抑制作用,这种负反馈循环使得HOTAIR在前列腺癌的进程中持续高表达,并加速前列腺癌的恶性进展。