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冠状病毒是一类对人类和动物均造成严重危害的病原体,对世界各国的经济发展、农业发展、公共卫生安全等均造成严重危害,其中猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus,FIPV）对动物健康构成了严重威胁,二者均为α属冠状病毒。猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）的致死率极高,尤其免疫功能尚未完善的仔猪,其死亡率为100%。目前,该病的防控主要依靠疫苗,但是在临床上不能提供100%保护,并且尚无可对该病进行有效防控与治疗的特效药物。猫传染性腹膜炎（Feline infectious peritonitis,FIP）是目前危害猫科动物健康的重要疾病之一,传染性高且致死率为100%。临床治疗中3C样蛋白酶(3C-like protease,3CLpro)抑制剂GC376得到了广泛使用,目前该抑制剂在治疗前期取得了较好疗效,但停药后发现存在复发现象,影响治疗的效果,降低治愈率。本研究首次证明3CLpro抑制剂GC376在细胞水平和生化水平上,对PEDV的抑制效果,为猪流行性腹泻的治疗提供了新思路。通过分子对接,模拟了PEDV3CLpro-GC376的结合模式,解释了其抑制作用的分子机制。同时,在GC376的基础上进行分子改造,并测评了改良化合物的抑制效果,为药物改良提供了指导。最后,在低浓度GC376压力下对FIPV进行传代,获得耐药毒株,为阐明冠状病毒耐药机制奠定基础。本研究具体工作内容分为以下四个方面:1. 抑制剂GC376对PEDV的抑制效果。在生化水平上,测定了GC376对PEDV3CLpro的半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50),值为966 n M。通过Western blot检测在药物的各个浓度梯度下,病毒含量的变化,发现GC376浓度达到25μM时,无法检测到PEDV的N蛋白。在细胞水平上,测定GC376对PEDV YN144的半最大效应浓度(Concentration for 50%of maximal effect,EC50),值为14.66μM。同时通过间接免疫荧光技术（Indirect Immunofluorescence Assay,IFA）,进一步验证GC376对PEDV病毒的抑制效果,结果表示1.56μM的GC376可减轻病毒感染,并在约6.25μM浓度时几乎完全抑制了病毒复制,细胞膜融合现象消失,最终浓度达到12.5μM时,GC376可完全抑制病毒复制。2. 模拟PEDV 3CLpro与GC376的结合。采用分子对接的方法,模拟了底物GC376和受体蛋白PEDV 3CLpro之间的结合模式。在模拟结果中,蛋白酶和化合物之间存在广泛的疏水相互作用:GC376与PEDV 3CLpro的六个氨基酸残基形成氢键相互作用,即His41、Gly142、Ala143、Cys144、His162、Gln163。GC376可以通过封闭PEDV 3CLpro活性位点,即第144位半胱氨酸,抑制PEDV 3CLpro的切割活性。说明由于3CLpro具有保守的催化活性中心,抑制剂GC376可以快速进入细胞,作用于PEDV 3CLpro,最终有效地抑制病毒的复制。3. GC376改良药物的药效测评。通过荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）检测3CLpro对不同的荧光多肽底物的切割活性,发现亮氨酸是PEDV 3CLpro的目前所测试范围内荧光多肽底物P2位点上最优选的氨基酸残基。之后,本研究测试改良药物Target 1和Target 2的抑制效果,认为可以在S2位为亮氨酸的基础上对GC376进行合理的设计改造,从而达到更好的抑制效果。4. FIPV耐药毒株的全基因组分析。本研究通过将野生型FIPV-791146毒株在抑制剂压力下进行50代次的传代培养,获得具有耐药性的毒株,通过EC50的测定、Western blot检测以及IFA技术,对比了抑制剂GC376对野生型毒株与耐药毒株的抑制效果。分析耐药毒株的全基因组序列后,发现冠状病毒对抑制剂GC376的耐药性分子机制并非由于靶向蛋白酶3CLpro的突变所导致,而是多种病毒蛋白的协同作用。这为3CLpro抑制剂的优化改良提供了指导。综上所述,本文验证了3CLpro抑制剂GC376对PEDV的抑制作用,模拟了PEDV3CLpro与GC376的结合,对GC376改良药物的药效进行了测评,最后探究了冠状病毒对GC376产生耐药性的分子机制。不仅为猪流行性腹泻的治疗提供一种新的方案,也为3CLpro抑制剂的进一步优化与研发提供指导。