研究背景随着生活水平的提高,脂肪类食品大量摄入引起机体脂质代谢异常,血脂水平升高,动脉粥样硬化的发病率日益增加。动脉粥样硬化是缺血性心脏病和脑卒中的主要病因,可引起血管管径狭窄,组织器官血流灌注不足,严重威胁人类健康。动脉粥样硬化的特征性病理改变是泡沫细胞的形成,泡沫细胞来源于定植在血管壁的巨噬细胞和血管平滑肌细胞,泡沫细胞参与了动脉粥样硬化发生发展的各个时期,因此明确泡沫细胞的形成机制对于防治动脉粥样硬化具有重要意义。先前的研究多集中于巨噬细胞的泡沫化而关于平滑肌细胞的泡沫化研究较少,本课题着重探讨平滑肌细胞泡沫化的防治策略。银杏叶是一味历史悠久的中药,银杏叶提取物则因其在抗氧化应激、抗炎症反应方面的功效而广泛应用于临床多种心血管疾病的辅助治疗。银杏叶提取物对动脉粥样硬化的保护作用在临床和动物实验中均有报道,然而,其作用机制尚未完全阐明。本课题拟探讨银杏叶提取物对平滑肌细胞泡沫化的影响及其机制。研究目的本课题旨在研究银杏叶提取物对动脉粥样硬化过程中平滑肌细胞泡沫化的影响及相关的分子机制,为银杏叶提取物临床治疗动脉粥样硬化提供实验证据。方法与结果1.银杏叶提取物浓度依赖性抑制ox-LDL诱导的平滑肌细胞泡沫化采用不同浓度的ox-LDL处理平滑肌细胞,油红O染色结果显示,ox-LDL处理可诱导平滑肌细胞泡沫化。而银杏叶提取物标准品EGb761共孵育显著抑制了脂滴的形成,并且具有浓度依赖性。细胞内胆固醇含量测定结果与油红O染色结果一致,EGb761处理抑制了ox-LDL引起的胆固醇含量增加。进一步采用Dio-ox-LDL孵育平滑肌细胞,结果显示,EGb761浓度依赖性降低平滑肌细胞对脂蛋白的摄取能力。采用NBD胆固醇孵育平滑肌细胞,分别检测培养基中的胆固醇含量及细胞内胆固醇含量以反映平滑肌细胞的胆固醇外排能力,结果显示,EGb761预处理可显著增加平滑肌细胞的胆固醇外排能力。随后检测了EGb 761孵育对平滑肌细胞胆固醇自身合成的影响。胆固醇的从头合成主要受SREBP2、HMGCR和LDLR等分子的调控,蛋白免疫印迹实验表明,EGb 761孵育对上述基因的表达没有影响。结果提示,EGb 761对平滑肌细胞泡沫化的抑制作用与平滑肌细胞胆固醇合成能力无关,而主要与平滑肌细胞摄取和外排胆固醇能力的改变相关。2.银杏叶提取物对平滑肌细胞摄取胆固醇途径的影响平滑肌细胞对胆固醇的摄取依赖于细胞膜表面的受体和脂蛋白的结合。SR-A1、CD36和LOX-1是介导细胞摄取胆固醇的主要分子。蛋白免疫印迹实验结果表明,采用ox-LDL处理平滑肌细胞可上调SR-A1、CD36和LOX-1的表达,而EGb761孵育平滑肌细胞可降低SR-A1和LOX-1的表达,但对CD36的转录水平没有影响。转录因子c-Jun和c-Fos的核转位并与激活子蛋白AP1结合是调控SR-A1转录表达的主要机制。蛋白印迹实验检测c-Jun和c-Fos在细胞核内的表达水平,结果表明,EGb761孵育下调了细胞核中c-Jun和c-Fos的水平,提示EGb761可能是通过抑制c-Jun和c-Fos的核转位抑制了SR-A1的表达。LOX-1的表达受炎症因子的调控,因此,我们检测了NF-κB的核转位情况,结果显示,ox-LDL处理可上调NF-κB在胞核中的水平,而EGb761孵育下调了NF-κB在胞核中的表达,提示EGb761通过抑制NF-κB的激活抑制了LOX-1的表达。3.银杏叶提取物对平滑肌细胞外排胆固醇途径的影响胆固醇被细胞摄取后会经历水解-脂化-再水解的过程,然后经膜转运体ATP结合盒转运体A1（ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1）、ATP结合盒转运体G1（ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1）和清道夫受体B1（SR-B1）转运至胞外。EGb761孵育可提高平滑肌细胞外排胆固醇的能力,进一步我们检测了EGb761对ABCA1、ABCG1和SR-B1表达的影响。蛋白免疫印记实验结果显示,EGb761孵育可显著上调ABCA1的蛋白表达,而对ABCG1和SR-B1的蛋白表达水平没有影响。进一步的RT-PCR实验结果显示,EGb761孵育增加了ABCA1的转录水平,而EGb761对ABCG1和SR-B1的转录没有显著影响。4.银杏叶提取物调控平滑肌细胞ABCA1表达的分子机制目前认为ABCA1的表达受ERK1/2信号通路的负性调控,ERK1/2激活可抑制ABCA1的表达,而抑制ERK1/2的激活可促进ABCA1的表达。因此,我们检测了EGb761孵育对平滑肌细胞ERK1/2信号通路的影响,结果显示,ox-LDL处理浓度依赖性激活了ERK1/2信号通路,下调了ABCA1的表达,而EGb761孵育平滑肌细胞可抑制ERK1/2的激活,恢复ABCA1的表达。随后,我们采用ERK1/2的阻断剂U0126孵育平滑肌细胞,发现ERK1/2磷酸化水平降低而ABCA1的表达增加,提示阻断ERK1/2的激活可模拟EGb761对ABCA1的调控作用。最后,采用EGb761和ERK1/2的阻断剂U0126共孵育平滑肌细胞,结果发现两者对ABCA1的上调作用没有叠加效应,提示EGb761是通过抑制ERK1/2的激活发挥上调ABCA1的调控作用。5.PAQR3介导银杏叶提取物诱导平滑肌细胞上调ABCA1EGb761抑制ERK1/2激活的机制目前尚不明确,而PAQR3是调控ERK1/2磷酸化水平的重要分子。首先,蛋白免疫印记实验结果显示,使用EGb761处理平滑肌细胞上调了PAQR3的表达,而ox-LDL处理下调了PAQR3的表达。RT-PCR结果也显示,PAQR3的mRNA水平受EGb761和ox-LDL的调控。随后,我们在给予EGb761处理平滑肌细胞的同时采用siRNA干扰PAQR3的表达,结果显示,干扰PAQR3的表达解除了EGb761对ERK1/2的抑制作用及ABCA1的上调作用。最后,我们构建PAQR3的过表达质粒,转染入平滑肌细胞,结果显示,过表达PAQR3可抑制ERK1/2的活性,并进一步上调ABCA1的表达,上述结果表明,EGb761可通过上调PAQR3的表达而抑制ERK1/2的激活,进而上调ABCA1的表达。6.PAQR3介导银杏叶提取物上调平滑肌细胞胆固醇外排及抑制泡沫化进一步将EGb761孵育的同时给予干扰或过表达PAQR3然后检测平滑肌细胞胆固醇外排能力。结果显示,干扰PAQR3抑制了EGb761对平滑肌细胞胆固醇外排的促进作用,而单纯过表达PAQR3可促进平滑肌细胞的胆固醇外排,而在孵育EGb761的同时过表达EGb761对平滑肌细胞外排胆固醇的能力有进一步提高的趋势,但无统计学差异。7.银杏叶提取物改善高脂饮食诱导的ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化采用高脂饮食饲养ApoE^-/-小鼠构建动脉粥样硬化模型,同时给予EGb761灌胃处理,观察银杏叶提取物对动脉粥样硬化的治疗作用及相关分子的表达变化。油红O染色实验显示,EGb761处理显著减小了主动脉斑块面积,而蛋白免疫印迹实验结果显示,EGb761部分抑制了造模组SR-A1、CD36和LOX-1的表达上调,同时,EGb761抑制了造模引起PAQR3表达下调,抑制了ERK1/2的磷酸化水平,恢复了ABCA1的表达。结论本课题发现银杏叶提取物抑制ox-LDL诱导的平滑肌细胞泡沫化,这一作用与银杏叶提取物抑制平滑肌细胞的摄取胆固醇能力并提高平滑肌细胞的外排胆固醇能力有关。银杏叶提取物通过抑制转录因子c-Jun、c-Fos及NF-κB的转录活性抑制SR-A1和LOX-1的表达,通过上调PAQR3,抑制ERK1/2的活性,上调ABCA1的表达,这是银杏叶提取物抑制平滑肌细胞泡沫化的相关分子机制。本课题揭示了银杏叶提取物抗动脉粥样硬化的一种机制,为其在临床上的应用提供了实验佐证。