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研究背景三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)在工业上被广泛应用为清洗剂、脱脂剂、杀菌剂,低浓度长期接触会引起“TCE药疹样皮炎”(Occupationnal Dermatitis Medicamentosa-like of Trichloroethylene,ODMLT)并伴随严重的多脏器损伤,肾脏损伤引发的肾功能衰竭也成为患者死亡的主要原因。三氯乙烯在工业上用量非常巨大并且短期内不能够被禁止使用,随着工业的不断发展,职业性接触三氯乙烯的人群越来越庞大,因此对于三氯乙烯引发的肾脏损伤机制研究在ODLMT患者的预防和治疗中尤为重要。大量临床病例显示以往的迟发型变态反应并不能完全解释肾脏损伤机制,本课题组前期研究发现TCE致敏小鼠肾脏存在血浆激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system,KKS)以及核因子NF-κB的活化,并且两者的活化能够加重TCE致敏小鼠肾脏损伤。另有国外实验结果提示,KKS的活化对细胞的损伤可能通过上调核因子NF-κB的表达,从而上调细胞因子的表达,加重肾脏炎症反应。本实验通过建立成熟TCE致敏小鼠模型,使用KKS抑制剂PKSI-527来研究KKS激活加重肾脏损伤的机制。研究目的通过建立三氯乙烯致敏小鼠模型,采用腹腔注射KKS抑制剂PKSI-527特异性抑制KKS活化,研究KKS相关指标和NF-κB相关指标的相关性,明确KKS在三氯乙烯致敏小鼠模型中肾脏免疫性损伤的作用机制。研究方法选取健康雌性6-8周BALB/c小鼠40只,在本实验室经过适应性喂养一周后随机分为空白对照组(共5只),溶剂对照组(共5只),TCE处理组(共15只),PKSI-527+TCE处理组(共15只)(在TCE处理的基础上每只小鼠给予KKS抑制剂PKSI-52750mg/kg)。于末次激发后24小时后观察并记录实验小鼠背部受试区皮肤反应情况并按照《化学品毒性鉴定技术规范》进行评分分组,将TCE处理组分为TCE致敏阳性组和TCE未致敏组,PKSI-527+TCE处理组分为PKSI-527+TCE致敏阳性组和PKSI-527+TCE未致敏组。收集小鼠血清,在安徽医科大学第一附属医院生化室检测各组小鼠血清CR,BUN水平;在无菌条件下取小鼠肾脏组织,一只冻存于-80℃冰箱,用于实时定量PCR检测肾脏P65,Tnf-α,IL-1β,IL-6,IL-17基因水平上的表达,免疫蛋白印记法检测小鼠肾脏磷酸化P65蛋白的表达水平;另一只置于10%多聚甲醛溶液中固定,用于苏木素-伊红染色,观察小鼠肾脏病理变化,免疫荧光方法检测小鼠PK表达情况。结果1致敏情况所有受试动物均未出现意外死亡,经皮肤致敏反应实验,发现空白和溶剂对照组小鼠皮肤均未出现红斑或者水肿现象,15只TCE处理的小鼠中,有6只出现红斑水肿,致敏率为40%;PKSI-527+TCE处理组共15只小鼠中,有4只出现红斑水肿,致敏率为26.67%。2肾脏损伤病理检查结果空白对照组和溶剂对照组小鼠肾脏没有出现病理学改变;与溶剂对照组小鼠相比,TCE致敏阳性组小鼠肾脏中出现肾小球旁器畸形增生和肾小管结构的改变,部分肾小管上皮细胞出现溶解现象。与TCE致敏阳性组小鼠相比,PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠肾脏中肾小球旁器增生和肾小管畸形明显减少,病理改变明显改善。3肾功能检查结果肾功能监测结果显示:与空白组小鼠相比,溶剂对照组小鼠血清Cr,BUN水平无明显变化,差异没有统计学意义(P>0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏阳性组以及PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠血清BUN,Cr水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与相应未致敏组相比,TCE致敏阳性组以及PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠血清BUN,Cr水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与TCE致敏阳性组相比以及PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠血清Cr,BUN水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。4 KKS系统相关指标表达情况实时定量PCR结果显示:与空白组相比,溶剂对照组小鼠肾脏PK水平无明显变化,差异没有统计学意义(P>0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏阳性组以及PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠肾脏PK水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与相应未致敏组相比,TCE致敏阳性组以及PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠肾脏PK水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);而与TCE致敏阳性组相比,PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠肾脏PK水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。5核因子NF-κB相关指标表达情况实时定量PCR结果均显示:与空白组相比,溶剂对照组小鼠肾脏核因子P65核转录水平无明显变化,差异没有统计学意义(P>0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏阳性组以及PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠肾脏核因子P65核转录水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与相应未致敏组相比,TCE致敏阳性组以及PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠肾脏核因子P65核转录水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与TCE致敏阳性组相比,PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠肾脏核因子P65核转录水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫蛋白印记实验结果显示:与空白组相比,溶剂对照组P-P65蛋白水平无明显变化,差异没有统计学意义(P>0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏阳性组以及PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠肾脏P-P65蛋白水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与TCE致敏阳性组相比,PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠肾脏P-P65蛋白水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。6炎性细胞因子表达情况实时定量PCR结果显示:与空白组相比,溶剂对照组细胞因子Tnf-α,IL-1β,IL-6,IL-17核转录水平无明显变化,差异没有统计学意义(P>0.05);与溶剂对照组相比,TCE致敏阳性组和PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠肾脏细胞因子Tnf-α,IL-1β,IL-6,IL-17核转录水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与相应未致敏组相比,TCE致敏阳性组和PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠肾脏细胞因子Tnf-α,IL-1β,IL-6,IL-17核转录水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与TCE致敏阳性组相比,PKSI-527+TCE致敏阳性组小鼠肾脏细胞因子Tnf-α,IL-1β,IL-6,IL-17核转录水平明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1一定剂量TCE对BALB/c小鼠皮肤染毒可以引起致敏效应,并有肾脏损伤。2 TCE致敏小鼠导致肾脏损伤可能通过以下机制实现:KKS激活后,上调了NF-κB细胞信号系统,引起下游炎症因子的表达增多导致。