研究背景与目的卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,也是妇科肿瘤恶性程度最高的疾病。据统计,每年出现约22200个卵巢癌新诊断病例,同时超过约15000位卵巢癌患者出现死亡。卵巢癌的早期症状较为隐匿。当发现诊断该疾病时,患者的病情已多发展为中晚期。目前卵巢癌的治疗标准仍为手术治疗后辅助以铂类联合紫杉醇的化疗方案。但大部分患者最终出现对常规化疗药物耐药,从而限制了化疗药物的治疗效果。所以在过去的几十年中,卵巢癌的5年生存率仍徘徊在40%左右,并未出现明显的改善。在临床的治疗过程中,卵巢癌患者的预后很大程度上取决于患者对治疗的反应性,化疗方案的制定需根据患者的病情、手术经过、病理诊断等多因素进行综合评估。而实行个体化的治疗方案是目前国内外妇科肿瘤医师主要的研究目标及方向。紫杉醇作为卵巢癌治疗的一线化疗药物,其主要的抗肿瘤作用为诱导并促进肿瘤细胞的微管聚合,产生稳定的微管结构,阻止有丝分裂过程中细胞染色体的正常排列及分离,从而抑制细胞周期的进展,最终导致肿瘤细胞凋亡。一般认为,紫杉醇发挥抗肿瘤效应的重要机制是促进肿瘤细胞微管聚合,抑制肿瘤细胞微管解聚,使细胞分裂阻滞于G2/M期。在本实验室的前期研究中,通过RNAi文库技术与蛋白质免疫共沉淀,质谱分析等蛋白质组学的研究方式相结合,在AKT/GSK-3β信号通路中发现一个新基因KIAA1529可能参与了卵巢癌的紫杉醇耐药。本研究旨在探讨KIAA1529编码蛋白KA在多种肿瘤细胞系中的表达,并通过药物干预及RNA干扰技术探讨KA在GSK-3β信号通路中卵巢癌对紫杉醇耐药的作用及相关机制,为逆转卵巢癌治疗过程中出现的紫杉醇耐药提供一个可能的新的分子治疗靶点。方法收集本实验室相关肿瘤细胞系,用TRIzol法提取各肿瘤细胞系的总RNA,采用荧光实时定量PCR方法检测肺癌细胞系、乳腺癌细胞系及卵巢癌细胞系中KIAA1529基因mRNA水平的表达,用蛋白质印迹法检测卵巢癌细胞系中KIAA1529基因编码蛋白KA的表达。使用GSK-3β特异性抑制剂LiCl通过磷酸化抑制GSK-3β,同时在紫杉醇的作用下,采用蛋白质印迹法检测不同处理组卵巢癌SKOV3细胞中GSK-3β、 p-GSK-3β、KA的蛋白表达变化。用流式细胞仪检测各组细胞周期的变化及各组细胞有丝分裂指数的改变。采用对SKOV3细胞中的p-H3及α-tubulin进行免疫荧光染色,观察各组细胞中进行有丝分裂细胞比例的变化及细胞骨架形态的改变。用流式细胞仪检测各组理组细胞的凋亡情况。采用RNA干扰技术,将KA siRNA转染至卵巢癌SKOV3细胞,荧光实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测转染KA siRNA后对SKOV3细胞中KA表达的抑制效果。通过流式细胞仪检测在使用GSK-3β特异性抑制剂LiCl后,在紫杉醇作用下对照组与转染组细胞周期及细胞有丝分裂指数的变化。采用对对照组及转染组SKOV3细胞中p-H3及α-tubulin的荧光染色,观察两组间细胞有丝分裂细胞比例的变化及细胞骨架形态的改变。用流式细胞仪检测两组细胞的凋亡情况。使用GSK-3β特异性抑制剂LiCl后,在紫杉醇作用下,通过蛋白质印迹法检测卵巢癌SKOV3细胞中有丝分裂纺锤体检测点相关蛋白的表达变化。采用RNA干扰技术,将KA siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞,用蛋白质印迹法检测在使用GSK-3β特异性抑制剂LiCl后,紫杉醇作用下,对照组及转染组有丝分裂纺锤体检测点相关蛋白的表达变化。采用RNA干扰技术,将Aurora B siRNA转染至SKOV3细胞,用蛋白质印迹法检测转染Aurora B siRNA后,对SKOV3细胞中Aurora B蛋白表达的抑制效果。通过流式细胞仪检测对照组与转染组细胞有丝分裂指数的变化。采用对p-H3及a-tubulin的荧光染色,观察对照组与转染组细胞有丝分裂比例的变化及细胞骨架形态的改变。用流式细胞仪检测对照组及转染组细胞凋亡情况。结果1.通过荧光实时定量PCR检测,发现KIAA1529基因在肺癌,乳腺癌及卵巢癌细胞系中均有表达。通过蛋白质印迹法检测,发现KIAA1529基因编码蛋白KA在卵巢癌SKOV3、A2780、C13K及OV2008细胞系中均有表达。在卵巢病变组织中,良性病变组织中KA的表达高于恶性肿瘤组织,并且在恶性病变组中,低分化肿瘤组织中KA比高分化及中分化的肿瘤组织中表达明显降低。2.蛋白质印迹法检测提示,GSK-3β特异性抑制剂LiCl能明显增加p-GSK-3p蛋白的表达。同时LiCl及紫杉醇共同处理组,比单独使用紫杉醇处理组KA蛋白的表达明显升高。流式细胞仪检测结果显示,使用GSK-3β特异性抑制剂LiCl后能减弱紫杉醇对卵巢癌SKOV3细胞的G2/M期阻滞,同时有丝分裂指数降低。通过免疫荧光技术观察,SKOV3细胞在LiCl与紫杉醇共同作用下,相对于单用紫杉醇处理,阻滞于有丝分裂状态的细胞比例明显减少；同时出现细胞分裂期浓缩核结构及圆形细胞骨架结构的细胞比例明显减少。流式细胞仪检测发现LiCl与紫杉醇共同作用组,凋亡率较单用紫杉醇处理组降低。两组差异均有统计学意义。3.荧光实时定量PCR及蛋白质印迹法结果显示,转染KA siRNA后,卵巢癌SKOV3细胞中KA的mRNA与蛋白的表达显著下调,对KA表达的抑制效果明显。通过流式细胞仪检测,同样在LiCl与紫杉醇的作用下,转染组G2/M期阻滞较对照组明显,同时有丝分裂指数升高。通过免疫荧光技术观察,在LiCl与紫杉醇共同作用下,转染组阻滞于有丝分裂状态的细胞比例升高；通过对α-tubulin的荧光染色发现,相对于对照组,转染组出现细胞分裂期浓缩核结构及圆形细胞骨架结构的细胞比例明显升高。且流式细胞仪检测,与对照组相比,转染组细胞凋亡率明显升高。组间差异均有明显统计学意义。4.使用GSK-3β特异性抑制剂LiCl后,在紫杉醇作用下,蛋白质印迹法检测有丝分裂纺锤体检测点相关蛋白Aurora A、Aurora B、BUBR1、MAD2、CDC20,结果显示使用GSK-3β特异性抑制剂LiCl后,在紫杉醇作用下,MAD2及CDC20的表达无明显变化,仅有Aurora A、Aurora B、BUBR1蛋白出现相应的表达变化。在LiCl与紫杉醇共同作用下,相对于单用紫杉醇,Aurora A、Aurora B、BUBR1蛋白的表达均下调。转染KA siRNA后,在LiCl与紫杉醇的联合作用下,转染组与对照组相比,Aurora A与BUBR1蛋白的表达无明显改变,而Aurora B蛋白表达在转染组抑制KA表达后上调。5.蛋白质印迹法结果显示,转染Aurora B siRNA后,卵巢癌SKOV3细胞中Aurora B蛋白的表达显著下调,对Aurora B表达的抑制效果明显。流式细胞仪检测结果表明,单用紫杉醇处理后,相对于对照组,转染组细胞有丝分裂指数下,降。免疫荧光染色结果显示,与对照组相比较,转染组处于有丝分裂状态的细胞减少,同时转染组出现细胞分裂期浓缩核结构及圆形细胞骨架结构的细胞比例明显减少。经流式细胞仪检测,相对于对照组,转染组转染Aurora B siRNA后,在紫杉醇的作用下,凋亡率下降。结论新基因KIAA1529编码及其编码蛋白KA在卵巢癌细胞系中均有不同程度的表达。在卵巢病变组织中发现的KA表达差异显示,新基因KIAA1529编码蛋白KA与卵巢癌的分化有密切关系。在GSK-3β信号通路中,通过GSK-3β特异性抑制剂LiCl作用于卵巢癌SKOV3细胞,使细胞中的GSK-3β磷酸化从而达到抑制GSK-3β的效果。当细胞中的GSK-3β通过磷酸化被抑制后,在紫杉醇的作用下,SKOV3细胞中KA蛋白的表达升高,同时出现紫杉醇所诱导的卵巢癌SKOV3细胞G2/M期阻滞的效应减弱,使肿瘤细胞从紫杉醇所诱导的有丝分裂阻滞状态中逃逸,最终紫杉醇诱导的卵巢癌肿瘤细胞凋亡减少,从而产生对紫杉醇的耐药。而当通过RNA干扰技术抑制KA蛋白的表达后,逆转了上述通过LiCl磷酸化抑制GSK-3p产生的卵巢癌SKOV3细胞的紫杉醇耐药现象。说明通过磷酸化抑制GSK-3β所出现的卵巢癌细胞对紫杉醇耐药机制,可能是通过新基因编码蛋白KA的表达升高产生的。实验进一步证实,GSK-3β通过LiCl磷酸化被抑制后,在紫杉醇的作用下KA表达升高的同时,抑制了染色体过客蛋白复合物之一Aurora B蛋白的表达；而当通过RNA干扰技术抑制KA蛋白的表达,Aurora B蛋白的表达恢复。说明了KA表达的升高抑制了染色体过客蛋白Aurora B的表达,破坏了有丝分裂纺锤体检测点的功能,从而使细胞逃逸了紫杉醇诱导的有丝分裂阻滞,造成卵巢癌肿瘤细胞对紫杉醇的耐药。综上所述,本实验首次在卵巢癌细胞中对新基因KIAA1529编码蛋白KA的功能进行了初步的阐述。说明在GSK-3β信号通路中,KA作为GSK-3β的下游调控因子之一,通过对染色体过客蛋白复合物关键蛋白Aurora B表达的调节,参与了卵巢癌紫杉醇耐药；同时通过KA,也将GSK-3β信号通路与有丝分裂纺锤体检测点功能联系起来。因此,新基因KIAA1529编码的大分子蛋白KA可能成为逆转卵巢癌紫杉醇耐药的新的分子治疗靶点。