隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种危害广泛的人畜共患寄生性原虫,主要通过介水传播,引起腹泻,导致隐孢子虫病(cryptosporidiosis)。隐孢子虫病已被列为世界最常见6种腹泻病之一,目前针对隐孢子虫病还没有特效治疗方法。隐孢子虫卵囊体积微小,对各种环境因素具有很强的耐受力,水温较低环境中可存活长达数月,而且一般的消毒措施几乎对其没有灭活作用。隐孢子虫对饮用水安全构成严重威胁,发达国家早已把隐孢子虫列为水质标准,研究水中隐孢子虫的控制措施十分重要和迫切。本课题以活体荧光染色法为活性评价手段,对比研究了氯和臭氧灭活水中微小隐孢子虫卵囊的效果,并在超微结构、酶活力和核酸3个方面初步探讨氯和臭氧灭活微小隐孢子虫卵囊的机制,为水中隐孢子虫的灭活措施选择提供理论参考和技术依据。主要研究内容与结果如下:1.卵囊增殖与回收以免疫抑制的BALB/c小鼠为动物模型,对微小隐孢子虫卵囊进行体内增殖。实验表明,BALB/c小鼠接种卵囊前7d灌胃DEX 0.15mg/只进行免疫抑制,接种当天在饮水中加DEX 20mg/L和庆大霉素40mg/L,自由饮用,能够实现对微小隐孢子虫卵囊的体内增殖,且重复性好。对饱和氯化钠、饱和硫酸锌、不连续蔗糖密度梯度离心和饱和硫酸锌-不连续蔗糖密度梯度离心4种纯化卵囊方法进行比较研究发现,用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化卵囊具有回收率高、对卵囊活性影响小等优点。2.卵囊检测与鉴定对隐孢子虫卵囊检测与活性鉴定方法进行研究发现,改良抗酸染色法对卵囊检测易产生假阳性;常规PCR检测卵囊的特异性和灵敏性均较好,能够区分与染色相混淆的杂质,如酵母等,降低了假阳性率;套式PCR比常规PCR敏感性更好,最低检出限可达到少于1个卵囊/mL;基因提取方法改善表明超声法比冻融法提取效率高;PCR法只能检测卵囊存在,不能检测其活性,活体荧光染色法利用荧光显微镜可以进行卵囊活性检测与鉴定。3.氯和臭氧消毒效果评价本研究对比评价了氯和臭氧对卵囊灭活效果,同时研究了浓度、消毒接触时间、水温和pH对两消毒剂消毒效果影响,结果发现,从消毒剂剂量和时间效应上臭氧消毒都明显优于氯消毒, 3mg/L臭氧10 min之内,灭活率达到99.99%,而3mg/L氯120min,灭活率仅达到37.43%。温度对氯和臭氧消毒效果影响不同,臭氧在较低温度(4℃)下消毒效果更好,而氯在较高温度下(30℃)更能发挥灭活作用;pH对氯和臭氧卵囊灭活效果相同,偏酸条件(pH6.0)有利于氯和臭氧对卵囊灭活。4.氯和臭氧消毒机制初探本研究试验观察了经氯和臭氧消毒处理后隐孢子虫卵囊在超微结构、抗氧化酶与能量代谢酶、以及基因组结构3个方面的变化,初步探讨两消毒剂对卵囊的灭活机制,结果发现:超微结构:扫描电镜下未处理组卵囊呈圆球形,卵囊表面光滑,结构清楚;臭氧处理组卵囊破坏程度与臭氧消毒剂剂量和时间上存在效应关系。氯处理组卵囊变化与臭氧处理组大致相同,只是出现破坏时氯浓度更高,消毒时间更长;透射电镜发现规律上与扫描电镜类似,先出现卵囊皱缩,继而结构开始遭到破坏,子孢子漏出,卵囊死亡。酶活力变化:对抗氧化系统酶研究结果表明,氯和臭氧抑制卵囊抗氧化系统,氯和臭氧对卵囊囊膜产生氧化作用,使得MDA升高,抗氧化酶T-AOC降低,且存在剂量和效应关系;对能量代谢酶试验结果表明,ATP酶活力降低,与消毒剂剂量存在效应关系,ATP酶降低使得ATP分解减少,能量运行减少,可能抑制卵囊的生命活动;释放能量受到抑制,对与产生能量相关酶是否有影响,对能量代谢途径关键酶LDH进行研究结果表明,LDH变化不明显,对于其他与能量产生相关酶是否产生影响,需要进一步研究。核酸变化:本研究对超微结构、酶活力进行研究外,我们应用随机扩增长度多态性分析技术(AFLP)对消毒剂是否对核酸作用进行了研究,AFLP具有准确性高,重复性好,结果可靠等特点,该技术步骤包括DNA提取、酶切、连接、预扩增、选择性扩增、PAGE、银染等步骤。若同一酶切片段没有被氯和臭氧破坏,处理组和未处理组经PAGE在特定的位置出现相同的片段,若发生变化,则出现差异片段。本实验应用EcoRI和MseI内切酶进行双酶切,设计20对引物对各组进行扩增,尽可能多的了解氯和臭氧对整个基因组作用情况,运用同一对引物对处理组和未处理组分别进行扩增,经PAGE显示结果发现,氯和臭氧处理后各组与未处理组出现差异片段,根据这些差异片段出现情况分为4类型,说明处理组对基因结构造成了影响。综合分析本研究的结果,我们得出以下结论:1.臭氧灭活卵囊效果明显优于氯。氯消毒对隐孢子虫卵囊灭活差,国家规定消毒饮用水氯浓度不超过4mg/L,从我们的实验结果可以得知,3mg/L氯灭活效果差,在实际应用中可行差;臭氧对隐孢子虫卵囊灭活效果好,国家规定臭氧水消毒浓度不超过0.3mg/L,从我们实验得知,0.3mg/L臭氧60min能达到99%以上,由于臭氧半衰期短,建议将臭氧和氯联合进行微小隐孢子虫卵囊消毒。2.对卵囊囊膜结构破坏损伤与抗氧化系统酶活力变化相一致,推测主要是由于氧化作用造成的,氧化作用是氯和臭氧灭活卵囊主要机制;氯和臭氧可以造成卵囊基因组DNA损伤,对基因组损伤是否有其他机制存在,需要进一步开展实验探讨。对于囊膜结构、酶活力和基因组遭到破坏的先后次序,需要进一步研究。3.确定了AFLP技术可应用于氯和臭氧灭活卵囊对基因组损伤分析,为消毒机制研究提供了技术依据。4.成功建立了微小隐孢子虫动物感染模型;确定了不连续蔗糖密度梯度离心是从小鼠粪便纯化卵囊的理想方法。5.确定了PCR检测卵囊的特异性和灵敏性较好;套式PCR检测的灵敏度高于常规PCR;活性荧光染色法可用于卵囊活性鉴定和消毒效果评价。