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研究背景和目的：原发性肝细胞癌发病率高，致死率高，被称为“癌中之王”。肝癌的具体发病机制尚未完全阐明，但目前的研究认为异常的细胞凋亡和肝癌的发生发展有着密切联系。肝癌对常规的放化疗敏感度均很低，进一步提示在肝癌细胞内可能存在着的一套高效而复杂的抗凋亡体系。miRNA是一类长度为18-24个核苷酸的单链非编码RNA分子，通过和靶基因的mRNA非编码区结合从而阻遏蛋白质翻译或诱导mRNA的降解，在转录后水平达到基因沉默的效应。目前人体大约有60%左右的基因表达受到miRNA的调控。miRNA在肿瘤的生物学行为中扮演者重要角色。miR-1就是已被广泛证实的一个抑癌基因。miR-1在许多实体瘤中均有表达的缺失或下调，功能学研究发现miR-1对多种肿瘤细胞具有抑制增殖，诱导凋亡，减少侵袭的作用。miR-1的作用机制也非常广泛，miR-1可以作用于c-met,细胞周期蛋白（CCND2），转录因子FoxP1等重要的原癌基因从而在多种实体瘤中发挥抑癌效应。在miR-1与肝癌的研究方面，有文献报道miR-1能通过调控内皮素-1（ET-1）的表达从而抑制肝癌细胞的增殖，也有研究发现miR-1能靶向抑制肝癌细胞HepG2中ETS1的表达，而ETS1能促进细胞外基质的降解从而介导了肿瘤细胞的侵袭和转移。还有文献报道miR-1能通过作用于转录因子E2F诱导肝癌细胞向普通肝细胞表型分化，但关于miR-1对肝癌细胞凋亡的影响及其机制的研究鲜有报道。我们拟在肝癌细胞Hep3B中过表达miR-1然后观察其对细胞凋亡的影响，并在此基础上寻找可能的作用机制，为进一步理解miR-1对肝癌的抑癌效应及探索肝癌治疗的策略提供一定的理论和实验基础。方法：第一部分过表达miR-1质粒对Hep3B细胞的转染及凋亡检测1.构建过表达hsa-miR-1-1基因的真核表达型质粒，按照非脂质体转染试剂attractene transfection reagent操作指南将质粒转染进细胞，并设置转染空质粒的阴性对照组（NC）和未行转染的空白对照组（blank）。转染后48h观察报告基因绿色荧光蛋白(GFP)表达情况，RT-qPCR检测转染后细胞miR-1表达水平以评估转染后目的基因的表达情况。2.转染48h后用annexin V/PI双染后行流式细胞仪分别检测miR-1组、nc组、blank组细胞凋亡情况，分析指标为早期凋亡（即annexin V阳性/PI阴性）率。第二部分生物信息学方法分析miR-1下游靶点及其在肝癌中的表达情况1.使用targetscan, miRTarBase and PicTar等软件预测miR-1的下游靶点，并从中筛选和细胞凋亡功能密切相关的分子。2.收集临床切除的原发性肝细胞癌组织及其癌旁组织共16对，Western Blot检测组织中我们挑选的下游靶点蛋白的表达情况。第三部分miR-1对下游靶点mRNA及蛋白水平表达的影响1.将过表达miR-1的细胞，nc组细胞及blank组细胞提取总RNA后行RT-qPCR检测我们挑选的潜在靶点mRNA表达变化。2.将过表达miR-1的细胞，nc组细胞及blank组细胞提取总蛋白后行Western Blot检测其我们挑选的潜在靶点蛋白表达变化。结果：第一部分过表达miR-1质粒对Hep3B细胞的转染及凋亡检测1.转染后48h miR-1组和nc组均有大量绿色荧光蛋白表达，提示质粒转染成功。将转染后48h细胞提取总RNA行RT-qPCR结果显示转染过表达目的基因组miR-1的表达远高于nc组，具有显著的统计学意义（P＜0.01），提示miR-1过表达成功。2.转染后48h行annexin V/PI双染及流式细胞仪检测结果显示，转染miR-1过表达质粒组细胞的早期凋亡率为（30.27±2.62）%；转染空质粒载体的nc组早期凋亡率为（4.13±0.92）%；未行转染的空白对照组细胞早期凋亡率为（1.91±0.36）%，miR-1组和nc组的结果具有明显的统计学差异（P＜0.01）。第二部分生物信息学方法分析miR-1下游靶点及其在肝癌中的表达情况1.生物信息学分析结果显示BAG4可能是miR-1的下游作用靶点。而BAG4已证实能通过与细胞内死亡结构域特异性结合从而发挥抗凋亡作用。2.16对临床样本的western blot结果显示：BAG4蛋白在肝癌组织中的表达较癌旁组织明显升高，western blot灰度值分析具有统计学意义（P<0.01）。第三部分miR-1对下游靶点mRNA及蛋白水平表达的影响4.RT-qPCR结果显示转染过表达miR-1质粒细胞的BAG4mRNA表达水平较转染空质粒的nc组细胞明显降低，二者具有统计学差异（P<0.01）。5.western blot结果显示细胞过表达miR-1后BAG4蛋白的表达较nc组和blank组显著下降，而nc组和blank组之间无明显差异。结论：1. miR-1对肝癌细胞Hep3B具有显著的凋亡诱导作用。2.生物信息学分析结果提示BAG4是miR-1的潜在作用靶点，经16对临床样本检测发现具有抗凋亡功能的BAG4蛋白在肝癌组织中的表达高于癌旁组织。3.miR-1可以在mRNA和蛋白水平降低BAG4的表达。miR-1可能通过抑制BAG4表达从而诱导肝癌细胞Hep3B凋亡。