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先天性全身脂肪营养不良(congenital generalized lipodystrophy)的主要临床特征是全身脂肪组织减少、胰岛素抵抗、高脂血症。先天性全身脂肪营养不良是一种常染色体隐性遗传病，临床基因检测结果共发现有4种基因AGPAT2，BSCL2(seipin)，CAV1和PTRF突变。因此，先天性全身脂肪营养不良被分为四型。11号染色体长臂的seipin基因无义突变(seipin缺失)是先天性全身脂肪营养不良II型的发病机制。区别与其它三型先天性全身脂肪营养不良，先天性全身脂肪营养不良II患者不仅有全身的脂肪组织丢失、胰岛素抵抗、高脂血症，还出现认知功能障碍的表型。但是，有关seipin缺失影响中枢神经系统功能的病理机制迄今仍然不明确。
原位杂交和免疫组织染色的检测发现海马、大脑皮层、下丘脑、脑干和小脑等脑区选择性表达seipin蛋白。免疫组织染色已确定海马的锥体细胞表达seipin蛋白。我们课题组检测全身性seipin基因敲除(seipin-sKO)，脂肪细胞选择性seipin基因敲除(seipin-aKO)和神经细胞选择性seipin基因敲除(seipin-nKO)小鼠，明确了神经细胞seipin缺失可能直接影响小鼠的认知功能，因为脂肪细胞seipin缺失引起脂肪组织减少，没有认知功能异常。
早期的研究已确定，无论脂肪细胞或者海马神经细胞都高表达seipin蛋白。seipin基因敲除或敲低都可以减少脂肪细胞和海马神经细胞过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ,PPARγ)的表达。降低神经细胞PPARγ水平可以引起糖原合成酶激酶3β(glycogensyntheseskinase3beta，GSK3β)磷酸化增加。用PPARγ激动剂罗格列酮处理seipin-nKO小鼠和seipin-sKO小鼠能阻止GSK3β的活化。
有研究发现，seipin缺失通过降低PPARγ的表达水平能促进α-synuclein磷酸化、聚集体形成和纤维化。阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)是一种以β-淀粉样蛋白沉积、老年斑形成、tau蛋白的异常过度磷酸化和神经原纤维缠结为病理特征，以进行性认知功能减退为主要临床症状的神经退行性疾病。AD脑的PPARγ水平与非认知障碍的同龄人相比明显减少。GSK3β过表达小鼠显示tau蛋白的磷酸化水平增加。流行病学的调查显示，糖尿病患者的AD发病风险明显增高。胰岛素抵抗导致持续的高血糖也会增加tau蛋白的磷酸化水平。因此，本课题提出“seipin缺失是否通过降低PPARγ水平或产生胰岛素抵抗来改变海马tau蛋白的聚集或磷酸化，引起神经变性和认知功能障碍”的科研设想。
研究目标：
(1)明确seipin缺失是否影响海马tau蛋白的聚集或磷酸化。
(2)探讨seipin缺失改变tau蛋白聚集或磷酸化的分子机制。
实验方法：
1.动物模型的制备和鉴定：本研究使用5月龄的雄性seipin-sKO小鼠、seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠和同窝的野生型(WT)小鼠由北京大学医学院刘国庆教授提供。用PCR方法进行小鼠尾部、脂肪组织和海马神经细胞seipin缺失的基因型鉴定。
2.药物处理：PPARγ激动剂罗格列酮(rosiglitazone，简称rosi)，PPARγ阻断剂GW9962，GSK-3β抑制剂AR-A014418，mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)，PI3K抑制剂LY294002，JNK抑制剂SP600125。
3.用Morris水迷宫试验的登台潜伏期进行空间认知功能的评价。
4.空腹血糖用葡萄糖氧化酶法检测。胰岛素敏感性通过胰岛素耐量实验(ITT)检测。
5.进行海马组织的甲苯胺蓝染色，计数CA1区锥体细胞。
6.用抗人神经丝蛋白H(NF-H)抗体进行海马脑片免疫染色。
7.用蛋白免疫印记法(Western-Blot)检测海马组织的tau蛋白单体和二聚体水平，tau蛋白不同位点的磷酸化(T212/S214、S202/T205、S396或S235)，PPARγ表达水平，GSK3β蛋白和GSK3β磷酸化(T216和S9磷酸化位点)水平，Akt和mTOR蛋白和磷酸化水平，LC3I/II和P62蛋白水平，JNK和P38蛋白和磷酸化水平。
实验结果：
1.与同龄野生型(WT)小鼠相比，seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠在Morris水迷宫实验中登台潜伏期明显延长，但是seipin-aKO小鼠没有改变。与同龄WT小鼠相比，seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠海马的PPARγ表达水平明显降低。对seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠进行连续30天PPARγ激动剂rosi给药能恢复Morris水迷宫实验中登台潜。这些结果提示神经系统seipin缺失通过减少PPARγ引起小鼠的认知功能减退。
2.甲苯胺蓝染色结果显示，5月龄seipin-sKO小鼠、seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠的海马面积、神经细胞的结构排列，CA1区锥体细胞的数量与WT小鼠相比都没有明显的改变。但是人神经丝蛋白H(NF-H)免疫染色显示，seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠的NF-H阳性神经纤维数量减少和变细。此外，NF-H蛋白水平在seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠海马也低于WT小鼠。这些结果提示神经系统seipin缺失引起海马神经纤维丢失、变性。
3.与同龄WT小鼠相比，seipin-sKO小鼠、seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠海马的tau单体蛋白水平没有明显差异，但是seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠tau二聚体蛋白水平明显增高。这些结果提示神经系统seipin缺失引起tau蛋白的集聚。
4.与同龄WT小鼠相比，tau蛋白(T212/S214和S202/T205)磷酸化水平在seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠都明显增加；tau蛋白(S396)磷酸化水平在seipin-sKO小鼠发生升高，但是tau蛋白(S235)磷酸化水平在seipin-sKO小鼠、seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠都没有明显改变。这些结果提示神经系统seipin缺失增加tau蛋白(T212/S214，S202/T205)的磷酸化，而全身性seipin缺失增加tau蛋白(T212/S214，S202/T205和S396)的磷酸化。
5.对seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠进行连续7天PPARγ激动剂rosi给药，能纠正tau蛋白(T212/S214，S202/T205)磷酸化水平增加，但是不改变tau蛋白(S396)的磷酸化增加。这些结果提示神经系统seipin缺失通过减少PPARγ引起tau蛋白(T212/S214，S202/T205)的磷酸化水平增加。
6.与同龄WT小鼠相比，seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠海马GSK3β的Tyr216位点磷酸化水平增加，和Ser9位点的磷酸化水平降低。与我们前期报道一致[46]，海马神经元的GSK3β活性增强。连续7天rosi给药处理seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠能纠正GSK3β(Tyr216)磷酸化增加和GSK3β(Ser9)磷酸化降低。此外，GSK3β抑制剂AR-A014418连续7天处理能降低seipin-nKO小鼠海马tau蛋白(T212/S214，S202/T205)磷酸化水平。根据这些试验结果，我们提出神经系统seipin缺失通过减少PPARγ水平，增加GSK3β活性，促进海马tau蛋白(T212/S214，S202/T205)的磷酸化。
7.与同龄WT小鼠相比，seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠海马Akt和mTOR蛋白水平没有明显改变，但是磷酸化水平明显增加。连续7天rosi给药能阻止seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠的Akt和mTOR磷酸化水平增加。这些结果提示，神经系统seipin缺失通过减少PPARγ能增强Akt-mTOR的信号通路。
8.与同龄WT小鼠相比，seipin-nKO小鼠海马IC3II蛋白水平降低，导致IC3II与IC3I的比例值降低；伴有p62蛋白水平提高，提示神经细胞seipin缺失减弱了自噬活性。连续7天mTOR抑制剂rapamycin或PI3K抑制剂LY294002给药能恢复seipin-nKO小鼠的细胞自噬活性，降低tau蛋白二聚体水平，但是GSK-3β抑制剂AR-A014418没有作用。这些结果提示，神经系统seipin缺失通过增强Akt-mTOR信号通路抑制了细胞自噬功能，减少tau蛋白聚集体的清除。
9.与同龄WT小鼠相比，seipin-sKO小鼠，seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠的空腹血糖水平没有明显改变。胰岛素敏感试验的检查结果显示，seipin-sKO小鼠在胰岛素注射后15，30和60分钟的血糖水平明显高于WT小鼠，但是seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠与WT小鼠相比没有明显改变，提示全身seipin的缺失诱发胰岛素抵抗的表型。
10.与同龄WT小鼠相比，seipin-sKO小鼠海马的JNK和P38蛋白水平没有改变，但是JNK磷酸化水平增加。seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠海马JNK和P38的蛋白或磷酸化水平都没有明显改变。连续30天rosi处理能改善seipin-sKO小鼠的胰岛素抵抗，纠正JNK磷酸化增加。但是连续7天rosi，rapamycin或AR-A014418处理对seipin-sKO小鼠胰岛素抵抗和JNK磷酸化增加没有作用。
11.连续30天rosi处理或连续7天JNK抑制剂SP600125处理能纠正tau蛋白(S396 )磷酸化增加。但是JNK抑制剂SP600125对seipin-sKO小鼠tau(T212/S214，S202/T205)磷酸化水平增加没有作用。这些结果提示，seipin缺失引起的胰岛素抵抗通过增强JNK信号通路能促进tau蛋白(S396)的磷酸化。
结论：
(1)神经细胞seipin缺失通过减少PPARγ引起GSK3β活性增强，促进海马tau蛋白(T212/S214，S202/T205)的磷酸化。
(2)神经细胞seipin缺失通过减少PPARγ促进Akt-mTOR信号通路，抑制细胞自噬，降低对tau蛋白聚集体的清除。
(3)神经细胞seipin缺失通过增加海马tau蛋白的磷酸化和聚集引起神经纤维的变性，导致认知功能障碍。
(4)seipin缺失引起的胰岛素抵抗，通过增加海马JNK磷酸化水平，促进tau(T396)的磷酸化。
原位杂交和免疫组织染色的检测发现海马、大脑皮层、下丘脑、脑干和小脑等脑区选择性表达seipin蛋白。免疫组织染色已确定海马的锥体细胞表达seipin蛋白。我们课题组检测全身性seipin基因敲除(seipin-sKO)，脂肪细胞选择性seipin基因敲除(seipin-aKO)和神经细胞选择性seipin基因敲除(seipin-nKO)小鼠，明确了神经细胞seipin缺失可能直接影响小鼠的认知功能，因为脂肪细胞seipin缺失引起脂肪组织减少，没有认知功能异常。
早期的研究已确定，无论脂肪细胞或者海马神经细胞都高表达seipin蛋白。seipin基因敲除或敲低都可以减少脂肪细胞和海马神经细胞过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ,PPARγ)的表达。降低神经细胞PPARγ水平可以引起糖原合成酶激酶3β(glycogensyntheseskinase3beta，GSK3β)磷酸化增加。用PPARγ激动剂罗格列酮处理seipin-nKO小鼠和seipin-sKO小鼠能阻止GSK3β的活化。
有研究发现，seipin缺失通过降低PPARγ的表达水平能促进α-synuclein磷酸化、聚集体形成和纤维化。阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)是一种以β-淀粉样蛋白沉积、老年斑形成、tau蛋白的异常过度磷酸化和神经原纤维缠结为病理特征，以进行性认知功能减退为主要临床症状的神经退行性疾病。AD脑的PPARγ水平与非认知障碍的同龄人相比明显减少。GSK3β过表达小鼠显示tau蛋白的磷酸化水平增加。流行病学的调查显示，糖尿病患者的AD发病风险明显增高。胰岛素抵抗导致持续的高血糖也会增加tau蛋白的磷酸化水平。因此，本课题提出“seipin缺失是否通过降低PPARγ水平或产生胰岛素抵抗来改变海马tau蛋白的聚集或磷酸化，引起神经变性和认知功能障碍”的科研设想。
研究目标：
(1)明确seipin缺失是否影响海马tau蛋白的聚集或磷酸化。
(2)探讨seipin缺失改变tau蛋白聚集或磷酸化的分子机制。
实验方法：
1.动物模型的制备和鉴定：本研究使用5月龄的雄性seipin-sKO小鼠、seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠和同窝的野生型(WT)小鼠由北京大学医学院刘国庆教授提供。用PCR方法进行小鼠尾部、脂肪组织和海马神经细胞seipin缺失的基因型鉴定。
2.药物处理：PPARγ激动剂罗格列酮(rosiglitazone，简称rosi)，PPARγ阻断剂GW9962，GSK-3β抑制剂AR-A014418，mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)，PI3K抑制剂LY294002，JNK抑制剂SP600125。
3.用Morris水迷宫试验的登台潜伏期进行空间认知功能的评价。
4.空腹血糖用葡萄糖氧化酶法检测。胰岛素敏感性通过胰岛素耐量实验(ITT)检测。
5.进行海马组织的甲苯胺蓝染色，计数CA1区锥体细胞。
6.用抗人神经丝蛋白H(NF-H)抗体进行海马脑片免疫染色。
7.用蛋白免疫印记法(Western-Blot)检测海马组织的tau蛋白单体和二聚体水平，tau蛋白不同位点的磷酸化(T212/S214、S202/T205、S396或S235)，PPARγ表达水平，GSK3β蛋白和GSK3β磷酸化(T216和S9磷酸化位点)水平，Akt和mTOR蛋白和磷酸化水平，LC3I/II和P62蛋白水平，JNK和P38蛋白和磷酸化水平。
实验结果：
1.与同龄野生型(WT)小鼠相比，seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠在Morris水迷宫实验中登台潜伏期明显延长，但是seipin-aKO小鼠没有改变。与同龄WT小鼠相比，seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠海马的PPARγ表达水平明显降低。对seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠进行连续30天PPARγ激动剂rosi给药能恢复Morris水迷宫实验中登台潜。这些结果提示神经系统seipin缺失通过减少PPARγ引起小鼠的认知功能减退。
2.甲苯胺蓝染色结果显示，5月龄seipin-sKO小鼠、seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠的海马面积、神经细胞的结构排列，CA1区锥体细胞的数量与WT小鼠相比都没有明显的改变。但是人神经丝蛋白H(NF-H)免疫染色显示，seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠的NF-H阳性神经纤维数量减少和变细。此外，NF-H蛋白水平在seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠海马也低于WT小鼠。这些结果提示神经系统seipin缺失引起海马神经纤维丢失、变性。
3.与同龄WT小鼠相比，seipin-sKO小鼠、seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠海马的tau单体蛋白水平没有明显差异，但是seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠tau二聚体蛋白水平明显增高。这些结果提示神经系统seipin缺失引起tau蛋白的集聚。
4.与同龄WT小鼠相比，tau蛋白(T212/S214和S202/T205)磷酸化水平在seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠都明显增加；tau蛋白(S396)磷酸化水平在seipin-sKO小鼠发生升高，但是tau蛋白(S235)磷酸化水平在seipin-sKO小鼠、seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠都没有明显改变。这些结果提示神经系统seipin缺失增加tau蛋白(T212/S214，S202/T205)的磷酸化，而全身性seipin缺失增加tau蛋白(T212/S214，S202/T205和S396)的磷酸化。
5.对seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠进行连续7天PPARγ激动剂rosi给药，能纠正tau蛋白(T212/S214，S202/T205)磷酸化水平增加，但是不改变tau蛋白(S396)的磷酸化增加。这些结果提示神经系统seipin缺失通过减少PPARγ引起tau蛋白(T212/S214，S202/T205)的磷酸化水平增加。
6.与同龄WT小鼠相比，seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠海马GSK3β的Tyr216位点磷酸化水平增加，和Ser9位点的磷酸化水平降低。与我们前期报道一致[46]，海马神经元的GSK3β活性增强。连续7天rosi给药处理seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠能纠正GSK3β(Tyr216)磷酸化增加和GSK3β(Ser9)磷酸化降低。此外，GSK3β抑制剂AR-A014418连续7天处理能降低seipin-nKO小鼠海马tau蛋白(T212/S214，S202/T205)磷酸化水平。根据这些试验结果，我们提出神经系统seipin缺失通过减少PPARγ水平，增加GSK3β活性，促进海马tau蛋白(T212/S214，S202/T205)的磷酸化。
7.与同龄WT小鼠相比，seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠海马Akt和mTOR蛋白水平没有明显改变，但是磷酸化水平明显增加。连续7天rosi给药能阻止seipin-sKO小鼠和seipin-nKO小鼠的Akt和mTOR磷酸化水平增加。这些结果提示，神经系统seipin缺失通过减少PPARγ能增强Akt-mTOR的信号通路。
8.与同龄WT小鼠相比，seipin-nKO小鼠海马IC3II蛋白水平降低，导致IC3II与IC3I的比例值降低；伴有p62蛋白水平提高，提示神经细胞seipin缺失减弱了自噬活性。连续7天mTOR抑制剂rapamycin或PI3K抑制剂LY294002给药能恢复seipin-nKO小鼠的细胞自噬活性，降低tau蛋白二聚体水平，但是GSK-3β抑制剂AR-A014418没有作用。这些结果提示，神经系统seipin缺失通过增强Akt-mTOR信号通路抑制了细胞自噬功能，减少tau蛋白聚集体的清除。
9.与同龄WT小鼠相比，seipin-sKO小鼠，seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠的空腹血糖水平没有明显改变。胰岛素敏感试验的检查结果显示，seipin-sKO小鼠在胰岛素注射后15，30和60分钟的血糖水平明显高于WT小鼠，但是seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠与WT小鼠相比没有明显改变，提示全身seipin的缺失诱发胰岛素抵抗的表型。
10.与同龄WT小鼠相比，seipin-sKO小鼠海马的JNK和P38蛋白水平没有改变，但是JNK磷酸化水平增加。seipin-nKO小鼠和seipin-aKO小鼠海马JNK和P38的蛋白或磷酸化水平都没有明显改变。连续30天rosi处理能改善seipin-sKO小鼠的胰岛素抵抗，纠正JNK磷酸化增加。但是连续7天rosi，rapamycin或AR-A014418处理对seipin-sKO小鼠胰岛素抵抗和JNK磷酸化增加没有作用。
11.连续30天rosi处理或连续7天JNK抑制剂SP600125处理能纠正tau蛋白(S396 )磷酸化增加。但是JNK抑制剂SP600125对seipin-sKO小鼠tau(T212/S214，S202/T205)磷酸化水平增加没有作用。这些结果提示，seipin缺失引起的胰岛素抵抗通过增强JNK信号通路能促进tau蛋白(S396)的磷酸化。
结论：
(1)神经细胞seipin缺失通过减少PPARγ引起GSK3β活性增强，促进海马tau蛋白(T212/S214，S202/T205)的磷酸化。
(2)神经细胞seipin缺失通过减少PPARγ促进Akt-mTOR信号通路，抑制细胞自噬，降低对tau蛋白聚集体的清除。
(3)神经细胞seipin缺失通过增加海马tau蛋白的磷酸化和聚集引起神经纤维的变性，导致认知功能障碍。
(4)seipin缺失引起的胰岛素抵抗，通过增加海马JNK磷酸化水平，促进tau(T396)的磷酸化。