论文部分内容阅读
研究背景和目的脑血管病(cerebral vascular diseases, CVD)是危害人类健康及生命的三大疾病之一,而缺血性脑血管病(ischemic cerebralvascular disease, ICD)占其中大部分。我国脑血管病的患病率高,且有缓慢上升的趋势,每年新发病例超过150万例。临床死亡率高,后遗症多,迫切需要切实有效的治疗方法。目前,治疗ICD除了发病急性期3-6小时内的溶栓治疗外,尚没有更为有效的治疗措施。但由于溶栓治疗的严格时间窗限制,临床中符合治疗条件的病例即使在欧美发达国家占总病例的比例也非常低,因此,临床上大部分的脑缺血治疗方案为对症保守治疗,效果难以令人满意。近年,随着营养因子治疗在相关领域的进展,多种营养因子被用于脑缺血疾病临床前研究,并且取得令人振奋的动物实验结果。越来越多的研究者积极推动这一研究成果向临床应用转化。脑源性神经营养因子(brain derived neuro trophic factor, BDNF)是在脑内合成的一种蛋白质,它广泛分布于中枢神经系统内,在中枢神经系统发育过程中,对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用,并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应。BDNF在脑缺血、脊髓损伤、周围神经损伤、帕金森病等的研究中已经取得一定进展。因神经营养因子半衰期短,在局部维持和浓聚困难,治疗神经损伤时,需要持续静脉注射、反复多次给药,或者应用人工合成的材料缓释系统,增加感染及损伤等风险。CBD (collagen-bingding domain)为多肽结构,是研究胶原酶作用位点时发现的胶原结合区。应用PCR技术,将CBD-BDNF基因扩增,插入pET-28a载体,后转染E.coli,使E.coli表达目标蛋白,在神经营养因子结构基础上以一个CBD多肽结构修饰,行成CBD-BDNF。可使BDNF铆定于胶原表面,从而形成缓释系统。实验证明有CBD多肽的神经营养因子对神经损伤的修复作用明显好于普通神经营养因子。在大鼠的室管膜区,分布着大量Ⅰ型胶原,同时室管膜下区(subventricular zone, SVZ)为内源性神经祖细胞增殖的主要场所。因此,本课题的目的是研究靶向室管膜区胶原的BDNF脑内移植治疗缺血性脑卒中的效果,探讨CBD-BDNF治疗缺血性脑卒中的是否可以结合与室管膜区,在时间上形成缓释系统,作用时间更为长久,在空间上,更加直接的刺激室管膜下区的内源性神经祖细胞增殖,从而促进脑缺血损伤的恢复,为营养因子治疗缺血性脑卒中的临床应用提供实验依据。研究内容和方法拟建立大鼠大脑中动脉梗阻(middle cerebral atery occlusion, MCAO)脑缺血模型,以动物模型,研究胶原靶向的脑源性神经营养因子对脑缺血再灌注损伤的作用,为临床上选择高效的神经营养因子提供实验依据。课题研究共分为两部分。第一部分：以永久线栓法制作大鼠急性脑缺血模型,随机分为磷酸盐缓冲液组,BDNF治疗组。在侧脑室内分别注射NAT-BDNF10ul (0.5nmol), CBD-BDNF10ul (0.5nmol),磷酸盐缓冲液10ul。在注射后3h,12h,通过western评价营养因子是否能在局部形成缓释系统。治疗后2周,三组分别行神经功能学评分、免疫组化染色、Micro-PET, SPECT扫描,评价CBD-BDNF治疗大鼠脑缺血损伤的有效性及可能的作用机制。第二部分：评价micro-Single Photon Emission Computed Tomography/Computed Tomography (SPECT/CT)对大鼠活体状态下超急性期脑缺血的诊断价值。应用99mTc-双半胱乙酯(ECD)脑灌注断层显像技术,选取24只健康雄性成年SD大鼠,以线栓法制作大鼠急性脑缺血模型,术后6h内每隔1h分别行SPECT/CT检查、2,3,5三苯基氯化四氮唑(TTC)染色及HE染色。对组内不同时间点间梗死体积的比较采用单因素ANOVA,同一时间点TTC及SPECT/CT结果比较采用独立样本t检验。研究结果1.通过western blot及免疫组化证实,大鼠脑内室管膜分布丰富Ⅰ型胶原。2.以缺血损伤侧的脑室室管膜胶原基质为靶点,使CBD-BDNF在脑缺血损伤局部维持和浓聚,从而形成一个缓释系统,在注射后12h,脑室内已基本无NAT-BDNF,但仍可发现CBD-BDNF在局部浓聚。3.CBD结合区明显增强BDNF对损伤的修复效果。CBD-BDNF治疗组神经功能恢复好于NAT-BDNF组及磷酸盐缓冲液组,在室管膜下区域细胞增殖活跃。CBD-BDNF治疗组梗塞周边区的神经元存活数目及血管密度明显多于磷酸盐缓冲液组,micro-PET结果显示梗塞侧有代谢活性脑组织增多。SPECT/CT灌注显像显示灌注缺失区域明显减少。4.脑源性神经营养因子能改善脑损伤大鼠的功能；上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,减少神经细胞凋亡,可能是其主要机制之一。5. SPECT所示缺血体积与TTC染色梗死区体积比较无统计学差异(P>0.05)。SPECT显示的低血流灌注区域,表现为放射性稀疏区域,与TTC染色粉红色区域相对应。缺血3h及以后梗塞面积基本趋于恒定,3h、4h、5h、6h各时间点梗塞面积比较无统计学意义(P>0.05)。HE染色表现：缺血1h、2h血管间隙增宽,神经细胞水肿；3h、4h、5h、6h,神经核固缩,血管周围大量空泡状改变。结论1. CBD-BDNF脑室内注射可以显著改善脑缺血大鼠神经功能的恢复,促进室管膜下区内源性神经祖细胞增殖,保护神经元,促进血管新生,抑制细胞凋亡。2. Micro-SPECT/CT可在活体状态下快速、准确、无创地评价脑缺血动物模型的脑部血流动力学改变,对超急性期脑梗死的评估及指导治疗决策提供有力的依据。