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第一部分小檗碱诱导儿童p53基因缺失白血病细胞凋亡的实验研究目的肿瘤细胞耐药多由于p53基因异常所致,小檗碱能够诱导多种肿瘤细胞发生细胞周期阻滞及细胞凋亡。本研究主要探讨小檗碱对儿童p53基因缺失的急性淋巴细胞白血病EU-4细胞凋亡诱导作用及其作用靶点。方法选取p53基因缺失的EU-4细胞进行实验,具体如下:(1)终浓度为0、1、10、50、100μmol/L小檗碱作用EU-4细胞72h,采用CCK-8检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,荧光显微镜观察凋亡细胞,免疫印迹方法(Western Blot)检测Bcl-2基因家族蛋白(BaxBcl-xl)及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达,比色法检Caspase-3的活性变化;(2)终浓度为100μmol/L小檗碱分别作用EU-4细胞0、24、48、72h, Western Blot检测PARP、Caspase-3及XIAP蛋白表达;(3)终浓度为50μmol/L Z-VAD-FMK预处理EU-4细胞30min,使用流式细胞仪观察小檗碱诱导EU-4细胞凋亡的变化;(4)终浓度为0、0.1、0.5、1.0μmol/L阿霉素作用EU-4细胞48h,Western Blot检测鼠双微粒体2(MDM2)和XIAP蛋白的变化;(5)使用小干扰RNA(siRNA)或小檗碱下调XIAP蛋白的表达,观察单纯降低XIAP表达或者联合阿霉素对于EU-4细胞凋亡的影响。结果(1)小檗碱作用EU-4细胞后,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),并呈浓度依赖关系,凋亡相关蛋白表达出现相应变化;(2)小檗碱诱导EU-4细胞凋亡主要依赖Caspase的活性,并且Caspase-3的活性显著增强(P<0.05);(3)小檗碱以浓度和时间依赖的方式下调XIAP蛋白的表达;(4)阿霉素无明显诱导EU-4细胞凋亡的作用,MDM2及XIAP蛋白表达亦无明显变化;(5)单纯下调XIAP蛋白的表达引起EU-4细胞明显凋亡,与阿霉素共同作用后还能够增强EU-4细胞对于阿霉素的敏感性(P<0.05)。结论小檗碱能够以不依赖p53的方式诱导白血病EU-4细胞凋亡,XIAP作为小檗碱的作用靶点,参与了EU-4细胞的凋亡。第二部分小檗碱调控白血病细胞X连锁凋亡抑制蛋白表达的机制研究目的小檗碱能够以x连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)为作用靶点诱导白血病细胞凋亡。本研究主要探讨小檗碱调控儿童急性淋巴细胞白血病EU-4细胞中XIAP蛋白表达的具体分子机制。方法(1)终浓度为100μmol/L小檗碱分别作用EU-4细胞0、24、48、72h,采用聚合酶链反应(PCR)检钡XIAPmRNA变化;放线菌素D实验观察小檗碱对于XIAPmRNA稳定性的影响;(2)终浓度为0、1、10、50、100μmol/L小檗碱作用EU-4细胞72h,免疫印迹方法(Western Blot)检测细胞中鼠双微粒体2(MDM2)及磷酸化MDM2蛋白量以及亚细胞定位的变化;终浓度为100μmol/L小檗碱分别作用EU-4细胞0、24、48、72h,PCR检钡MDM2mRNA变化;(3)使用小干扰RNA(siRNA)下调EU-4细胞中MDM2蛋白的表达,Western Blot检测降低MDM2表达对于XIAP蛋白的影响;(4)采用放线菌酮实验观察小檗碱对于XIAP蛋白稳定性的影响,免疫共沉淀实验检测小檗碱对于XIAP蛋白泛素化的影响。结果(1)小檗碱不影响)IAP mRNA表达量及其稳定性;(2)小檗碱以浓度和时间依赖的方式下调MDM2蛋白表达,并且该调控可能发生在转录水平,小檗碱能够降低胞浆中MDM2蛋白水平;(3)siRNA下调MDM2表达以后引起XIAP蛋白表达的降低;(4)小檗碱增高XIAP蛋白自身的泛素化水平,降低XIAP蛋白的稳定性,使其通过泛素-蛋白酶体途径降解。结论小檗碱主要在转录后水平调控EU-4细胞中XIAP蛋白的表达,即小檗碱可能通过下调MDM2蛋白表达影响XIAP蛋白翻译,小檗碱诱导XIAP蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解。