芦荟遗传转化受体体系的建立及转基因研究

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:zhangchenlin
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芦荟属多年生百合科草本植物,原产于非洲的干旱地区,叶片厚实多肉,富含多种活性物质。现代研究证明芦荟具有泻下通便、清肝泄热、消疮杀虫、消炎、抗紫外线辐射、抗病毒、能提高人体免疫机能及滋养毛发等功效,已经被广泛应用于医药、食品、美容化妆产品的生产和研制。随着芦荟产业的发展,芦荟的需求量逐渐扩大,而传统的芦荟繁殖一般采用扦插和分株繁殖,这些方法受繁殖基数的限制,初期繁殖速度较慢,而且容易使病毒积累,影响植株生长,甚至退化。芦荟无性快速繁殖技术是获得大量芦荟种苗的一种重要方法,早在1974年Groenewad E用普勒多利亚种子培养出芦荟愈伤组织植株成功以来,国内外有关芦荟快繁的研究不断深入,已经建立起了相对成型的无性快繁体系。近年来,基于芦荟的药用、美容等功效,人们开始把目光投入到芦荟的遗传转化中,并取得了初步的进展。本文采用芦荟的茎段作为外植体,利用碱性成纤维细胞生长因子基因(bFGF)进行转化芦荟,获得具有祛疤作用的芦荟新品种,为今后开发以此转基因芦荟制成祛疤化妆品奠定了良好的基础,使芦荟这一热带药用植物资源能够更好地服务于人类。主要结果如下:1.建立了芦荟遗传转化受体体系,摸索出不同芦荟品种不定芽的诱导、继代以及生根的有效方法,为芦荟的遗传转化打下了坚实的基础。外植体最佳灭菌条件为用70%的酒精消毒30s,再用0.1%的升汞灭菌8min;不同的芦荟品种均可诱导出不定芽,诱导率的高低主要取决于基因型、培养基种类、激素浓度等。对于不定芽的诱导而言,MS培养基诱导效果优于1/2MS培养基,B5和N6培养基诱导效果较差。就激素而言,在不定芽的诱导和分化阶段,激素配比为6-BA2mg/L+NAA0.15mg/L时的诱导率较高。在芦荟的继代培养阶段,MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.1mg/L为最佳的继代培养基,MS+NAA2.0mg/L+活性炭0.3%为最佳的生根培养基。2.农杆菌介导的芦荟遗传转化技术:利用农杆菌介导法将bFGF基因导入木立芦荟中,研究农杆菌转化系统的条件,对不同类型的菌株、不同的菌液浓度、不同的侵染时间等条件进行探讨。通过对农杆菌介导芦荟遗传转化影响因素系统的研究,建立了优化的芦荟转化体系。用继代培养获得的粗壮的芦荟单株茎段作为转化外植体,在MS培养基上预培养3~5d,以OD600为0.6~0.8的EHA105农杆菌工程菌液侵染25min,在MS+蔗糖10g/L+100μmo/L乙酰丁香酮的共体培养基上培养3d,在MS+6-BA3mg/L+Cef400mg/L+Kan50mg/L的筛选培养基上培养60d,然后转至MS+6-BA2mg/L+NAA0.15mg/L的分化培养基进行培养,生根后移栽。根据出苗的抗性茎段进行统计,转化率可达4.8%。利用PCR对转基因植株进行初步检测,然后利用Southern杂交进一步验证外源基因bFGF已经整合到芦荟的基因组中。
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