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循环肿瘤细胞(CTCs)是恶性肿瘤转移的根源,外周血中CTCs的分离和检测在肿瘤的早期诊断、疗效监测、耐药性监测、预后评估及个体化治疗等方面都具有重要意义。本文基于流体力学技术、膜过滤技术和免疫荧光染色技术搭建了一套CTCs盘式分离装置,建立了一套CTCs分离检测方法;根据肿瘤细胞回收率和白细胞残留率筛选了最适孔径的分离膜;以肺癌细胞A549为细胞模型,通过构建“A549+5 mL PBS检测体系”和“A549+5 mL健康人静脉血检测体系”,进行了方法学评价;将本文方法与韩国Clinomics公司的CD-PRIME设备进行了比较;并使用本文方法对临床患者血样进行了分离。结果表明:8μm孔径的分离膜为最适分离膜;本文建立的分离方法总体稳定性和重复性良好(CV<5%);在5 mL PBS检测体系中,肿瘤细胞的回收率为73.59%±2.14%,最低可检测2个肿瘤细胞;在5 m L健康人静脉血检测体系中,肿瘤细胞的回收率为70.05%±5.89%,最低可检测3个肿瘤细胞,即本文方法分离CTCs的最低检测限为3个CTCs/5 mL外周血。本文建立的分离方法对肿瘤细胞的回收率(72.05%±2.62%)略低于CD-PRIME(74.58%±0.72%),基本达到市场商品化水平;使用本文方法成功应用于临床肺癌患者血样中CTCs的分离检测,4例患者血样中均成功分离出CTCs。本文在验证CTCs分离方法可行性的基础上,还成功将1 mL健康人静脉血中掺入的A549细胞分离并洗脱下来,实现了细胞的体外培养;通过qRT-PCR技术对体外培养的A549细胞CK18基因的转录水平进行了检测;通过一代测序技术和ddPCR技术对EGFR基因的突变进行了检测。结果表明:肺癌细胞A549中CK18基因的转录水平高于正常肺细胞;ddPCR技术检测到A549细胞样本中微量的EGFR-T790M和EGFR-L858R突变,而一代测序技术未检测到突变。本文建立的循环肿瘤细胞分离检测方法能够成功从外周血中分离出CTCs,运用此方法分离得到的肿瘤细胞具有生物活性,可进行体外培养,可对其培养物进行基因水平或转录水平的表征。本文研究结果为外周血循环肿瘤细胞的分离,鉴定及表征提供了实验室基础。