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谷氨酸特异性内肽酶（GSE）是一种对谷氨酸羧基形成的肽键具有很强专一性的丝氨酸蛋白酶，在蛋白质序列及结构分析、多肽合成及活性多肽回收方面有着广泛的应用。由于大多数谷氨酸特异性内肽酶的晶体结构目前无法获得，因此我们对于其底物特异性的机制还不够了解。地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶（GSE-BL）与应用较广泛的来自金黄色葡萄球菌V8菌株的谷氨酸特异性内肽酶（V8-GSE）相比，对谷氨酸有着更强的底物专一性和更高的催化效率。因此，对GSE-BL进行表达纯化，并对其结构及功能进行深入分析对于了解其作用机制及拓展谷氨酸特异性内肽酶的应用范围有着十分重要的意义。 重组GSE-BL前体在大肠杆菌胞内以无活性的包涵体形式表达，经过透析复性及胰酶处理后，我们得到有活性的成熟GSE-BL，其产量为140.5mg/L。Western blot鉴定、酶活力测定及氨基酸序列测定结果表明其复性过程中自切割形成中间体，其成熟化过程是逐步进行的。GSE-BL前体第-1位的赖氨酸突变成为谷氨酸后，可以在不引入外源胰酶的情况下得到成熟GSE-BL，从而为制备有活性的成熟提供了一种新方法。但突变后的GSE-BL对于Z-Phe-Leu-Glu-pNA的活性降低了27.4%，表明第-1位置的Lys突变成为Glu对GSE-BL的正确折叠有一定程度的影响。不包含前肽片段的GSE-BL在大肠杆菌中主要以可溶形式表达，相应纯化产物对Z-Phe-Leu-Glu-pNA几乎没有酶活力；27kDGSE-BL中间体主要以包涵体形式表达，相应成熟化产物对Z-Phe-Leu-Glu-pNA几乎没有酶活力，从而证明前肽的存在对于GSE-BL正确折叠形成有活性的构象是十分必要的。 对GSE-BL的酶学性质研究结果表明，GSE-BL的最适反应pH为8.5，最适反应温度为37℃，对Z-Phe-Leu-Glu-pNA的Km值为1.495±0.034mM，最大反应速率Vmax为50.237μmol/mg.min。2mM钙离子的存在能显著提高重组成熟GSE-BL在50℃的热稳定性，EDTA能部分抑制成熟GSE-BL的酶活力。GSE-BL对于Z-Phe-Leu-Glu-pNA的催化效率是对于Z-Asp-pNA的催化效率的925倍。 我们以已知晶体结构的中间芽孢杆菌谷氨酸特异性内肽酶（GSE-BI）为模板，对GSE-BL进行了同源建模，预测GSE-BL中存在由His47、Asp96和Ser167组成的通过质子传递形成的稳定的催化活性中心，并用点突变实验分别进行了验证。我们还通过点突变实验证明了Val2、Cys32、Arg89和His190对于GSE-BL催化活性中心的形成和其底物特异性的重要性。其中Val2参与底物结合口袋的形成，对于GSE-BL的正确折叠十分重要；Cys32与底物结合，且参与二硫键的形成；Arg89为底物结合口袋提供正电荷，方便底物进入口袋；而His190与Glu残基的γ-羧基结合，对谷氨酸的负电荷进行补偿。Cys181突变成为Ala会降低GSE-BL的热稳定性。Phe57突变成为Ala能使GSE-BL对于Z-Phe-Leu-Glu-pNA的催化效率提高50%。Asp51Arg、Glu101Ala和Glu104Arg的突变影响GSE-BL催化域的电荷分布，导致GSE-BL无法形成稳定的催化活性中心。 本论文将GSE-BL应用于重组蛋白标签切除和活性肽的成熟化。 透明颤菌血红蛋白（VHb）是一种能提高生物体对氧气利用率的血红蛋白。VHb在大肠杆菌内重组表达，GSE-BL酶切15min可去除91.6%VHb-His6的组氨酸标签，从而获得与天然VHb氨基酸序列一致的VHb。无标签VHb的产量为31.8mg/L。去除标签的VHb对CO的亲和力比VHb-His6更高。无标签VHb对过氧化氢的最大反应速率为1169μmol/g.min，而VHb-His6对过氧化氢的最大反应速率为781μmol/g.min。0.1mM无标签VHb添加到产碱杆菌ATCC31555发酵液中能使韦兰胶的产量提高16.2%，而添加0.1mM VHb-His6仅使韦兰胶产量提高4.9%。 人胰高血糖素是一种能促进肝糖原分解从而提高人体内血糖含量的活性多肽。我们在毕赤酵母菌株中重组表达了人胰高血糖素，重组人胰高血糖分泌到胞外上清液中，纯化的重组人胰高血糖素用GSE-BL处理1h能去除91.6%重组胰高血糖素的组氨酸标签，得到与人胰高血糖素标准品分子量大小一致及HPLC保留时间一致的短肽。去标签的胰高血糖素的产量为50.5mg/L。 人β防御素-2（HBD-2）是一种富含半胱氨酸的小分子阳离子抗菌肽。我们在大肠杆菌内对HBD-2前原肽进行了重组表达，在成熟HBD-2序列前引入Glu残基作为GSE-BL的识别位点。纯化后的HBD-2前原肽经GSE-BL处理1h得到成熟的HBD-2，其产量为23.2mg/L。成熟HBD-2对于铜绿假单胞菌的抑菌能力强于对金黄色葡萄球菌的抑菌能力。成熟HBD-2对人结肠癌细胞HCT-8的毒性要强于对小鼠骨髓来源的DC细胞的毒性。