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食管癌(esophageal carcinoma,EC)是一种常见的消化道恶性肿瘤,是第六最常见的癌症死亡原因,全球发病率居第八。中国食管癌的发病率居世界首位,在全世界食管癌40万/年的死亡人数,中国人约占一半之多。河南是我国食管癌的高发地区之一,尤其在河南省林州市。食管癌的病因可能与饮食习惯,生存环境,遗传等多种因素有关,它是一个及其复杂的渐进的过程,涉及多阶段,多因素,多基因。但其及发病机制病因尚不十分明确。虽然手术、放化疗等治疗手段不断提高,但5年生存率为19%,晚期食管癌仅为0.9%,预后极差。严重威胁人们的生存健康。寻求新的替代治疗手段势在必行,而基因靶向治疗已成为食管癌治疗的研究热点。PPM1D(WIP1)是一种原癌基因。它是野生型p53诱导的磷酸酯酶,具有丝/苏氨酸活性的蛋白磷酸酶,在多种肿瘤周期调控、细胞应激、细胞生长、DNA损伤与修复中发挥重要功能。研究表明,PPM1D在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中高表达,而在正常的食管组织中低表达。目前,国内外研究者在卵巢透明细胞癌、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、肝细胞癌、前列腺癌、膀胱尿路上皮癌、胰腺癌、甲状腺癌,胃癌,结直肠癌等领域对PPM1D基因的研究已有较大的进展,这些研究表明PPM1D与肿瘤的发生发展密切相关。目前,PPM1D与ESCC发生发展关系研究在国际上并未见相关报道。因此在本研究中,作者首先采用免疫组织化学法检测PPM1D在ESCC中的表达,并分析其过表达与ESCC患者临床生物学行为的关系;再利用RNA干扰技术使ESCC细胞株中PPM1D表达下调,再通过Western blotting技术研究检测PPM1DsiRNA的转入对各组ESCC细胞中PPM1D蛋白表达的干扰效率。通过流式细胞术及TUNEL技术分析下调PPM1D的表达对EC-1细胞凋亡的影响。采用划痕实验、transwell侵袭实验检测各组食管细胞浸润转移能力。最后利用Western blotting检测各组细胞中与细胞凋亡相关蛋白bcl-2和bax及浸润转移相关蛋白MMP2和MMP9相对表达量的变化。本研究目的在于初步探讨PPM1D在ESCC病因发病机制中可能的作用,为ESCC基因靶向治疗的新位点提供理论依据。方法首先检测ESCC组织标本中PPM1D的表达,然后利用脂质体2000将PPM1D siRNA和对照siRNA分别转染食管鳞癌EC-1细胞,进行如下分析:(1)采用免疫组织化学技术检测91例ESCC组织和对应的正常食管黏膜组织中PPM1D蛋白的表达并分析PPM1D蛋白的表达与ESCC病人临床病理学参数及预后之间的关系。(2)采用Western blotting检测PPM1D siRNA对各组食管鳞状细胞癌细胞中PPM1D的干扰效果。(3)运用流式细胞术和TUNEL技术检测PPM1D表达下调对食管鳞状细胞癌细胞凋亡的影响。(4)采用划痕实验和transwell侵袭实验检测各组食管癌细胞迁移和侵袭能力。(5)采用Western blotting检测各组细胞中与细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达的变化;浸润转移相关蛋白MMP2和MMP9的表达和变化。统计学处理:应用SPSS21.0统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用χ~2检验,多个样本均数比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA),检验水准α=0.05。结果(1)PPM1D在ESCC组织中的表达阳性率(57/91,62.6%)显著高于对应的正常食管上皮组织(16/91,17.6%),且差异具有统计学意义(χ~2=38.449,P<0.05)。PPM1D蛋白表达与ESCC患者的性别(χ~2=0.359,P>0.05)、年龄(χ~2=1.655,P>0.05)、组织学分期(χ~2=2.904,P>0.05)均无关,但与临床分级(χ~2=5.705,P<0.05)、浸润深度(χ~2=15.796,P<0.05)以及淋巴结转移(χ~2=8.340,P<0.05)均密切相关。(2)PPM1D siRNA转染后,与空白对照组和对照siRNA组相比,EC-1细胞PPM1D基因的蛋白表达下降,约为空白对照组和对照siRNA组的1/3,差异具有统计学意义(F=577.8,P<0.05)。空白对照组和对照siRNA组之间PPM1D的表达无差异(P>0.05)。(3)细胞凋亡结果表明,转染48h后,PPM1D siRNA组EC-1细胞早期凋亡率为6.1%,显著高于空白对照组和对照siRNA组的早期凋亡率(分别为:1.3%和0.7%),差异具有统计学意义(F=103.6,P<0.05)。而空白对照组和对照siRNA组的EC-1的活细胞数分别为97.4%和97.9%,显著高于PPM1D siRNA组的活细胞数(77.6%),差异具有统计学意义(F=102.5,P<0.05)。(4)TUNEL结果表明,在空白对照组和对照siRNA组中,两组细胞的凋亡差异无统计学意义(P>0.05)。然而,与空白对照组和对照siRNA组相比,PPM1D siRNA组在转染48h以后EC-1细胞的凋亡明显增加,差异具有统计学意义(F=34,P<0.05)。(5)划痕实验结果表明,在空白对照组和对照siRNA组中,EC-1细胞的迁移率差异无统计学意义(P>0.05)。然而,与空白对照组和对照siRNA组相比,PPM1D siRNA组在转染48h以后EC-1细胞的迁移明显受到抑制,差异具有统计学意义(F=126.8,P<0.05)。(6)Transwell实验结果表明,PPM1DsiRNA组中EC-1细胞的穿膜数为(43.6±20.17)显著低于空白对照组食管鳞癌EC-1细胞(129.4±26.87)和对照siRNA组食管鳞癌EC-1细胞(119.2±24.85),且差异具有统计学意义(F=114.37,P<0.05)。(7)Western blotting结果显示,与空白对照组和对照siRNA组相比,PPM1D siRNA组中bcl-2蛋白的表达均明显下调,且差异具有统计学意义(F=105.1,P<0.05);但bax蛋白的表达水平反而明显上升,且差异具有统计学意义(F=298.9,P<0.05)。此外,空白对照组和对照siRNA组之间Bcl-2、Bax的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。(8)Western blotting结果显示,与空白对照组和对照siRNA组相比,PPM1D siRNA组中MMP2蛋白和MMP9蛋白表达均明显下调,且差异均具有统计学意义(F=183,P<0.05;F=6.460,P<0.05);此外,空白对照组和对照siRNA组之间MMP2蛋白和MMP9的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论(1)PPM1D可能参与了食管鳞癌的发生、发展及侵袭和转移。(2)利用siRNA技术能有效下调EC-1细胞中PPM1D蛋白的表达。(3)PPM1D基因表达下调能明显诱导EC-1细胞凋亡并可显著抑制细胞侵袭,这可能与Bcl-2、Bax、MMP2和MMP9表达变化密切相关。