循环肿瘤细胞作为由原始肿瘤灶脱离进入外周循环血液的“种子”,在肿瘤转移过程中扮演着重要角色;检测血液中循环肿瘤细胞数量,对癌症早期诊断、治疗效果评估、药物敏感性测试以及肿瘤复发监测等临床应用具有重要意义。但鉴于血液中循环肿瘤细胞含量极低,每数十亿背景血细胞中仅含有1-100个循环肿瘤细胞,因此研究如何实现循环肿瘤细胞高通量、高精度的分选,是一项十分必要且极具挑战的工作。在综述微流控分选循环肿瘤细胞最新研究进展,并结合本课题组前期研究的基础上,本文深入研究了具有高通量分选优势的惯性螺旋分选技术,并在此基础上先后实现其与确定性侧向位移技术及磁力分选技术的集成,通过集成芯片高通量粗分选串接精确分选的多级模式,在肿瘤细胞快速、精确分离方面取得一定突破。取得的创新性研究成果如下:(1)研制一种简单结构高通量惯性螺旋肿瘤细胞分选芯片:提出一种简单结构螺旋流道,应用于血液中稀有肿瘤细胞分选研究。研究血细胞浓度及流速对分选精度的影响,并在血液稀释100倍、样品流进样速度400μL/min的最佳条件下开展血液中肿瘤细胞的分选试验。研究表明,设计螺旋结构初次分选可移除91.97±0.57%的血细胞,回收85.06±9.27%的MCF-7肿瘤细胞;而通过二次分选,可将血细胞移除率提升至约99.07%,同时将获取MCF-7纯度提升至8.10±2.63%,即实现其相对浓度81倍的提升,表现出较为优秀的分选性能。(2)研制一种集成惯性螺旋与确定性侧向位移技术的两级高通量、精确分选芯片:针对惯性螺旋技术在分选精度上的相对不足,引入对尺寸差异区分度高的确定性侧向位移(deterministic lateral displacement,DLD)分选技术作为补充并与之串联集成,以期更彻底地移除残余小尺寸血细胞。通过惯性螺旋粗分选与DLD精确提纯的顺序集成,实现肿瘤细胞高通量、高纯度的捕获。在集成芯片设计方面,巧妙的将位于惯性螺旋外壁面处的无粒子流引入二级DLD流道,并用之取代传统DLD芯片需额外引入的鞘液流,使最终集成芯片具备单一入口、三出口的简单结构,极大程度便捷了分选过程的操作。在对单级螺旋及DLD流道分别进行结构优化的基础上,对集成芯片展开流速与流阻匹配,制备原型器件对聚苯乙烯粒子近100%的分离展现出集成芯片在高通量、高精度分选方面的巨大优势及应用潜力。开展血液中MCF-7的分选研究,实验结果表明集成芯片相比于单级螺旋结构优势明显,较低浓度初始样品条件下捕获MCF-7的纯度甚至达到约93.59%的超高水平,血细胞移除率亦达到约99.94%。对初始样品中以500 cells/mL极低浓度存在的肿瘤细胞进行分选,亦能经DLD上侧出口富集并鉴别出荧光染色肿瘤细胞。开展裂解血液中肿瘤细胞分选实验,对尺寸与MCF-7存在重叠的白细胞移除率可达到98.63%的较高水平。此外,对捕获肿瘤细胞的再培养表明其仍能保持良好活性。(3)研制一种集成惯性螺旋与磁力分选技术的多级高通量、精确分选芯片:以上研究均采用基于尺寸的分选手段,惯性与DLD集成芯片在精确分离尺寸存在重叠的白细胞(直径约10-25μm)与肿瘤细胞(直径约15-40μm)方面依然存在较大局限。为克服此不足,引入不依赖尺寸的磁力分选技术,通过惯性螺旋与磁力手段依次移除小尺寸红细胞及反向磁珠标记白细胞,实现对肿瘤细胞高通量、高纯度、高回收率的捕获。集成芯片含有双入口螺旋惯性分选、非对称正弦流道惯性聚焦及磁力分选三级单元,并通过灵活性更高、成本更低的激光切割微加工工艺制备原型器件。对各单级结构展开设计与优化,分别对双入口螺旋及聚焦/磁力分选单元展开结构设计与优化,完成一层螺旋芯片搭配3层磁力分选芯片流速匹配,并在对各出口流阻补偿的基础上提出具有19层薄膜结构的集成芯片设计方案。利用集成芯片分选血液中肿瘤细胞,实验结果表明捕获肿瘤细胞可达到51.47±6.27%的高纯度及93.84±9.01%的高捕获率,降低样品液细胞浓度更可将捕获MCF-7的纯度提升至93.60±5.97%的极高水平。此外,集成芯片对超低浓度肿瘤细胞的分选也有上佳表现,且芯片较低的流阻及白细胞反向磁珠标记保证了分选所得肿瘤细胞的活性。