糖尿病是一种以持续性高血糖为特征的代谢性疾病,也是全世界高发病率的疾病之一。近些年来,随着人民生活方式的改变和生活水平的提高,糖尿病患病人数呈现逐年增长的趋势,已由2011年的3.66亿增长为2017年的4.51亿,预计到2045年全球糖尿病总患病人口将上升到6.93亿。其中2型糖尿病的发病率占总发病率的90%以上,危害程度也最大,可导致2型糖尿病肾病以及2型糖尿病伴发高血压等多种并发症,严重威胁人类的身体健康。金芪降糖片组方源于医学名家孙思邈的《备急千金方》消渴方中的“千金黄连丸”,是一种由黄连、黄芪以及金银花组成的纯中药制剂。具有清热益气、生津止渴的功效,临床上主要用于治疗中医消渴病气虚内热证以及轻、中度2型糖尿病患者。金芪降糖片组方中的黄连为君药,具有清热除湿、降火解毒的功效。黄芪为辅药具有补肺益气、生津止渴的功能。金银花具有清热解毒的功效,既可以帮助黄连清泻肺胃之火又可以滋阴润燥生津解渴,具有较好的止渴作用。现代药理研究表明金芪降糖片能够改善糖代谢,调节脂代谢,改善胰岛素抵抗,提高机体对胰岛素的敏感性,以及增强机体的免疫力。然而目前尚缺乏金芪降糖片对2型糖尿病并发症及其药效物质基础的研究。基于此,本论文采用体外分析化学与药效学相结合的方法,较为系统的研究了金芪降糖片对2型糖尿病肾病和2型糖尿病伴发高血压的改善作用及肾脏保护作用的物质基础。1、金芪降糖片成分分析及对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用研究首先采用高效液相-质谱联用的技术对金芪降糖片的甲醇提取物进行了分离鉴定,确定了包括小檗碱在内的十六个化合物的结构。然后探讨了金芪降糖片对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用。将所有SD大鼠适应性饲养一周后,随机选择10只大鼠作为空白对照组,标准饲料喂养4周,尾静脉注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。其余大鼠高脂饲料喂养4周建立胰岛素抵抗模型,禁食10小时后,尾静脉注射35mg/kg STZ,(将STZ溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液)复制2型糖尿病模型。STZ注射72小时后测定大鼠的血糖值,血糖值>16.7mmol/L视为2型糖尿病模型建立成功。造模成功的大鼠喂养一周后,利用考马斯亮蓝法对大鼠的24小时尿蛋白进行测定。将24小时尿蛋白为对照组2倍及以上者纳入接下来的实验。将已成模的大鼠随机分为模型组,金芪降糖片低剂量组以及金芪降糖片高剂量组,每组10只,连续药物干预6周。药物干预期间每周记录一次体重和血糖值,在实验结束前一天将所有组的大鼠禁食10小时,正常饮水,放入代谢笼留取24小时尿液,测量体积,检测肾功能各项指标,并计算肌酐清除率(CCr)。药物治疗最后一天,将所有组大鼠称重,腹腔注射10%水合氯醛(0.3m L/kg)麻醉,股动脉取血,离心取血清进行后续生化指标的检测。脱颈椎处死后取肾脏,称重,计算肾指数;肾脏组织匀浆后利用试剂盒测定大鼠肾脏中各氧化应激指标的活性;利用HE染色、PAS染色以及Masson染色观察肾脏组织病理变化情况;免疫组织化学法检测肾脏组织中凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2,细胞色素C以及Caspase-3的表达情况。实验结果分析发现,与空白对照组相比,糖尿病组大鼠的血糖值显著升高,经过6周的给药治疗后,金芪降糖片给药组的血糖值均出现明显降低,并呈现一定的剂量依赖性。对各组大鼠的一般状况观察发现,空白对照组大鼠皮毛光亮,反应敏捷,精神状态、饮食、饮水、尿量均正常,并且体重逐渐增加。与空白对照组相比,糖尿病组大鼠的皮毛枯黄,活动量减少,精神状态差,易怒,尿量显著增加,有明显的尿骚味,并且体重增加量下降。经过6周的给药治疗后,以上症状均有所缓解,其中以金芪降糖片高剂量组作用效果最为显著。大鼠的生化指标结果显示,与空白对照组相比,糖尿病组大鼠的TC、TG以及LDL-C含量明显增加,而HDL-C含量明显降低。经过6周的给药治疗后发现,金芪降糖片主要是通过降低TC、TG以及LDL-C含量,升高HDL-C的含量来改善糖尿病大鼠的脂质代谢紊乱。各组大鼠肾功能相关指标比较:与空白对照组相比,模型组大鼠的SCr、BUN、24小时尿蛋白和肾指数明显升高,而CCr显著降低。经过6周的药物干预后,与模型组相比,金芪降糖片给药组CCr明显升高,而SCr、BUN、24小时尿蛋白和肾指数显著降低,表明金芪降糖片具有改善肾肥大,提高肾功能的作用。通过对各组大鼠肾组织中氧化应激指标比较发现,金芪降糖片能够明显升高肾组织中抗氧化物酶SOD,CAT以及GSH-Px的活性,降低组织中MDA的含量,改善氧化应激所造成的损伤。光学显微镜下观察各组大鼠肾脏的组织病理改变,HE染色结果发现模型组大鼠肾小球增大,系膜区变宽;PAS染色结果显示肾小球肥大,肾小球基底膜厚度增加,糖原在肾脏中明显积聚;Masson染色表明模型组大鼠肾脏出现明显的纤维化,给予金芪降糖片治疗后,给药组肾组织的病理变化能够得到明显改善。免疫组化结果表明,模型组大鼠肾脏组织中Bax,Caspase-3和细胞色素C表达水平显著高于空白对照组,而Bcl-2的表达水平明显低于空白对照组。给予金芪降糖片药物干预后,与模型组相比,给药组大鼠主要是通过下调肾脏组织中Bax,Caspase-3和细胞色素C的表达水平,上调Bcl-2的表达来抑制细胞凋亡。因此,实验结果显示金芪降糖片能够提高2型糖尿病大鼠的肾功能,其作用机制可能与改善氧化应激,抑制细胞凋亡有关。2、金芪降糖片对糖尿病伴发高血压大鼠的改善作用研究将所有大鼠适应性喂养一周后,随机选10只作为空白对照组,其余为造模组,空白对照组大鼠给予普通饮食,而造模组大鼠采用高脂饲料喂养。4周后,将各组大鼠禁食12小时,空白对照组大鼠尾静脉注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液,造模组大鼠按30mg/kg尾静脉注射STZ。72小时后测定大鼠的血糖值,血糖值>16.7mmol/L视为2型糖尿病模型制备成功。随后,将已成模的2型糖尿病大鼠利用两肾一夹法制备糖尿病并发高血压模型。将糖尿病大鼠麻醉后,消毒备皮,腹部左侧切开,用生理盐水打湿的纱布包裹肾脏,将肾静脉及周围组织分开充分暴露肾动脉,穿单线备用,将直径为0.25mm的针灸针放置于肾动脉一侧并与肾动脉平行,用3-0缝合线结扎肾动脉后抽出针灸针,术后利用抗生素常规抗炎一周。手术后两周利用无创动脉血压计测定大鼠的尾动脉收缩压。收缩压≥140mm Hg,且血糖值>16.7mmol/L确定为糖尿病并发高血压模型。将已成模的大鼠随机分为模型组、金芪降糖片低剂量组以及金芪降糖片高剂量组,每组10只,连续药物干预6周。药物干预期间,每周测定大鼠的体重、血压及血糖值。药物干预最后一周进行口服糖耐量检测;实验结束前一天进行超声心动检测,评价其心功能。药物治疗最后一天,将所有组大鼠麻醉,股动脉取血,离心取血清进行后续相关指标的检测。颈椎脱臼处死后取胸主动脉以及心脏,HE染色评价其组织病理变化,观察金芪降糖片对糖尿病伴发高血压大鼠心血管的保护功能。实验结果表明,经过6周的药物治疗后,与模型组相比,金芪降糖片给药组血压以及血糖值均出现显著降低。血清学相关指标结果显示,与空白对照组相比,模型组大鼠Ang-II,ET-1,TC,TG,LDL-C含量均显著升高,而HDL-C含量显著降低,差异具有统计学意义。给予金芪降糖片进行药物干预后,HDL-C含量明显升高,而Ang-II,ET-1,TC,TG,LDL-C含量显著下降。对其氧化应激指标分析发现,与空白对照组相比,模型组SOD、NO和NOS含量降低,MDA含量升高,经过6周的给药治疗后,与模型组相比,金芪降糖片药物干预组MDA含量下降,抗氧化物酶活性升高,其中以金芪降糖片高剂量组的指标变化最为显著。超声心动结果显示,与空白对照组相比,模型组大鼠射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)显著降低,而左心室舒张期室间隔厚度(IVSd)以及收缩期室间隔厚度(IVSs)升高。经过6周的药物干预后,EF,FS水平升高,IVSd,IVSs水平显著降低。光学显微镜下观察发现,模型组大鼠胸主动脉结构不清晰,内膜厚度增加,内皮细胞肥大;心脏心肌细胞排列较为紊乱,间质有少量的炎性细胞浸润,并且部分可见条状的心肌成纤维细胞,给予金芪降糖片后,给药组胸主动脉以及心脏的组织病理变化能够得到明显改善。3、金芪降糖片活性成分小檗碱对2型糖尿病大鼠的肾脏保护作用研究在成分分析的基础上,进一步对金芪降糖片的主要活性成分小檗碱对2型糖尿病大鼠的肾脏保护作用进行了评价。将所有SD大鼠适应性饲养一周后,随机留取10只大鼠作为正常对照组,标准饲料喂养4周,尾静脉注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。其余大鼠高脂饲料喂养4周后,尾静脉注射35mg/kg STZ建立2型糖尿病模型。将所有成模的大鼠随机分为模型组,小檗碱低剂量组以及小檗碱高剂量组,连续药物干预8周。药物干预期间每周记录一次体重和血糖,在实验结束前一天将所有组的大鼠放入代谢笼收集24小时尿液,进行后续指标检测。在药物干预最后一天,将所有大鼠称重,麻醉,股动脉取血,离心取血清进行生化指标检测。取肾脏,称重,计算各组大鼠的肾指数;肾脏组织匀浆,利用试剂盒分析大鼠肾脏生化指标变化;利用HE染色、PAS染色以及Masson染色观察肾脏组织病理变化情况;免疫组化法以及蛋白印迹法检测肾脏组织中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3以及炎症相关因子TNF-α、NF-κB的表达情况。实验结果表明,与空白对照组相比,模型组大鼠FBG以及Hb A1c%水平明显升高,使用小檗碱干预后,FBG以及Hb A1c%水平显著降低,差异具有统计学意义。生化指标结果表明,与空白对照组比较,模型组大鼠BUN、SCr、24小时尿蛋白含量升高,而CCr下降;经过8周的给药治疗后与模型组相比,各小檗碱治疗组CCr水平明显升高,而BUN、SCr、24小时尿蛋白含量均出现了降低,并呈现一定的剂量依赖性。对肾脏生化指标分析发现,与空白对照组相比,模型组大鼠抗氧化物酶相关指标SOD、CAT、GSH和GSH-Px活性明显降低,而MDA、IL-1β和IL-6含量升高;与模型组相比,小檗碱给药组MDA、IL-1β和IL-6含量明显降低,而SOD、CAT、GSH和GSH-Px活性显著增加。免疫组化染色结果显示,模型组大鼠TNF-α表达水平明显高于空白对照组,小檗碱给药组的TNF-α表达情况低于模型组。HE染色结果显示模型组大鼠肾小球增大,系膜区变宽;PAS染色结果显示模型组大鼠肾小球基底膜厚度增加,糖原在肾脏中明显积聚;Masson染色表明模型组大鼠肾脏出现明显的纤维化,给予不同剂量的小檗碱治疗后,给药组肾组织的病理变化情况能够得到明显改善。Western Blot结果分析发现,与空白对照组相比,模型组大鼠肾组织中Bax、Caspase-9、Caspase-3以及NF-κB的表达水平明显升高,而Bcl-2表达水平明显降低。经过8周的药物干预后发现,小檗碱能有效下调肾组织中Bax、Caspase-9、Caspase-3以及NF-κB的表达,上调Bcl-2的表达水平。实验结果发现小檗碱能够减轻2型糖尿病大鼠肾脏的损伤程度,其作用机制可能与改善氧化应激,对抗炎症反应,抑制细胞凋亡有关,提示小檗碱可能是金芪降糖片发挥肾脏保护作用的主要物质。综上,本论文系统的评价了金芪降糖片对2型糖尿病肾病以及2型糖尿病伴发高血压的药效作用以及其发挥肾脏保护作用的物质基础,为其扩大临床适应症提供了理论依据。