论文部分内容阅读
通过富集培养，初筛，复筛，粘度快速测定以及薄层层析（TLC）分析，从自然界中分离到3株产内切壳聚糖酶活力较高的菌株。经形态、生理生化特征鉴定以及16S rDNA序列分析，3株均归属于Mitsuaria sp．，分别命名为013、和281。其中，Mitsuaria sp．141的产酶能力最强。以Mitsuaria sp．141为出发菌株，先后进行紫外诱变和60Co-γ射线诱变，选育到菌株Mitsuaria sp．141-2，其壳聚糖酶活力提高了30.01％。连续传5代，每代测定酶活力，结果表明，该菌株具有较好的遗传稳定性。通过单因素试验和多因素试验对Mitsuaria sp．141-2发酵进行了研究，得到了优化的产酶工艺：可溶性壳聚糖0.50％、装液量100 mL（500 mL三角瓶）、起始pH值7.0、接种量2％、温度30℃、摇床转速180 r／min、培养时间48 h，在此条件下，酶活力达3.631 U／mL。在10 L容量的发酵罐中扩大培养，装液量7 L、通气量1 vvm、搅拌速率200 r／min、温度30℃，培养36 h壳聚糖酶活力达最高值3.258 U／mL。TLC分析表明，壳聚糖的酶解产物中有壳二糖或其它壳寡糖存在。用乙酰丙酮法测定产物壳聚糖的数均分子量，结果表明，1.5％的壳聚糖胶体溶液与粗酶液体积比15：1，37℃、作用30 min，产物数均分子量降到10921。保持作用条件不变，改变体积比为10：1、5：1、2：1、1：1和1：2，产物的数均分子量逐渐变小，分别为5683、3018、1247、779和747。通过硫酸铵沉淀、离心超滤和Sephadex G-200凝胶柱层析，初步纯化了Mitsuaria sp．141-2壳聚糖酶，该酶为诱导酶，分子量33.6 kD，最适作用pH值为4.0，最适作用温度为37℃～42℃，在45℃以下、pH4.0～pH8.0的环境中较稳定。