乙酰胆碱酯酶(acetylcholinestrase，AChE，EC3.1.1.7)，是一种丝氨酸水解酶，主要存在于神经元和神经肌肉接头处。它的主要功能是快速水解神经递质乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)，从而终止ACh对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内正常传递，因此，在胆碱能神经传导过程中起着至关重要的作用。AChE是神经毒剂、有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标。杀虫剂通过和AChE结合，降低AChE活性，引起ACh在突触间隙的过量积累，导致昆虫的抽搐甚至死亡。此外，AChE还与细胞凋亡有关。　　为了研究AChE的结构与功能之间的相互关系，本文以家蚕为材料，作了如下研究：比较研究了辛硫磷农药诱导前后的两种ace（ace1和ace2）的转录水平；利用原核表达系统表达了ace1的编码区，并成功制备了兔多克隆抗体，检测了辛硫磷农药诱导后的脑组织中的ace1蛋白的表达水平；对AChE1关键位点进行突变，利用杆状病毒表达系统进行表达，测定了表达蛋白的生化属性以及抑制动力学属性；采用高通量测序技术测定了家蚕脑组织中的各基因转录水平，并以定量PCR检测了AChE调控相关基因在辛硫磷农药诱导后的转录水平。主要研究结果如下：　　1家蚕添食辛硫磷前后两种ace的转录特征　　采用了实时荧光定量PCR（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction）方法，研究了ace1和ace2基因在家蚕5龄幼虫各组织（中肠、丝腺、脂肪体、马氏管、血液、精巢、卵巢、脑）中的转录水平，以及在辛硫磷(4.0μg/mL)添食后的转录特征。结果表明，在正常的家蚕中， ace1在各组织中表达量差距很大，在脑组织中高量表达，在其他所有组织中只有微弱的表达，表达量仅为脑组织表达量的0.21%-3.68%。而ace2在各组织中的表达量差距不大，在中肠、丝腺和血淋巴中相对表达量较低，在脂肪体和卵巢中相对表达量较高。对比两种ace的转录水平发现， ace1在各组织中的表达量比ace2的表达量高，平均值为ace2表达量的13.50倍，脑组织中的ace1的表达量为ace2的95.97倍。在有机磷诱导24 h后，各组织ace1表达水平都有所提高，其中脑组织中ace1基因表达增加了1.81倍；大部分组织的ace2表达水平都有所提高，精巢和血淋巴中上升倍数最大，分别为3.48和4.22倍，脑组织中的表达量为诱导前的1.12倍。检测了辛硫磷诱导48h，脑组织中ace1和ace2的转录水平，结果表明，ace1和ace2的表达趋势一致，在24 h时呈增量表达，48 h时表达量最低，72 h表达量升高。Ace1的变化倍数大于ace2，农药诱导后的ace2在各组织中的表达也相对稳定。证明ace1是编码主要的AChE基因，与辛硫磷的关系更为密切，为研究两种AChE在家蚕生理过程中的作用机理打下了基础。　　2家蚕Ace1的克隆及抗体制备　　为了进一步研究ace1的功能，本研究将ace1的编码区克隆到表达载体pET28a上，转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，经0.1 mmol/L IPTG诱导进行原核表达。SDS-PAGE电泳分析表明，转化了ace1基因重组载体的BL21菌，在约76 kDa位置出现了一条特异性条带，而在对照组空BL21菌和转化了空载体pET28a(+)的菌在同样位置没有此特异性条带，说明ace1在大肠杆菌中得到正确表达。Western blottting分析结果表明，已经成功地表达出了带有6×His标签的融合蛋白。将表达的蛋白纯化后免疫家兔，成功制备了兔多克隆抗体，抗体效价为1:512000，为深入研究AChE1在家蚕组织中的表达，以及以后的功能研究打下了基础。　　3家蚕辛硫磷诱导前后AChE1在脑组织中的表达水平　　我们用制备的兔多克隆抗体检测 AChE1在中毒前后的家蚕脑组织的表达水平。结果表明AChE1在诱导24 h后表达量增加1.5倍，而48 h呈下降趋势，72 h后蛋白表达水平重新上升。证明AChE1在家蚕的辛硫磷抗性方面起着重要作用，和ace1的定量分析结果一致。　　4家蚕ace1的定点突变及真核表达　　为了研究家蚕 ace1特征位点的突变与杀虫剂抗性之间的关系，我们采用定点突变方法，对保守位点处的3个氨基酸进行了突变：Ala(GCG)303Ser(TCG)， Gly(GGA)329 Ala(GCA)， Leu(TCT)554 Ser(TTC)。利用杆状病毒表达系统对野生型ace1（wace1）和突变型ace1（mace1）进行真核表达。首先将野生型和突变型的 AChE基因（wace1和 mace1）进行亚克隆到转移载体pFastBacTMHT B中，然后转化Ac DH10Bac E coli大肠杆菌菌株，得到转移质粒bacmid，最后转染sf9细胞，得到重组蛋白。测序结果表明，已成功突变了目标碱基。SDS-PAGE和Western blotting方法检测到了特异性表达的目的蛋白，分子量大小约76 kDa，说明目的蛋白得到了正确表达，为ace1基因的结构和功能研究打下了基础。　　5表达产物的纯化及生化属性测定　　由于未纯化的粗酶液可能影响抑制剂和底物与酶的相互作用，我们利用Ni-NTA纯化系统对杆状病毒表达系统表达的野生型AChE1（wAChE1）和突变型AChE1（mAChE1）进行了纯化。并用AChE专一性抑制剂毒扁豆碱以及辛硫磷农药测定了其对表达产物的抑制作用。结果表明，经过纯化，我们得到了较为单一的目的蛋白，符合酶活测定的要求。对纯化产物进行生物学测定发现两种表达蛋白的酶促动力学属性没有明显差异，野生型的AChE1的Km为0.0305 mM，突变型的AChE1的Km为0.0284 mM，两种蛋白的 Vmax值分别为0.731和0.743μM min?1 mg?1。但是对专一性抑制剂的敏感性有所区别，突变后的 AChE1对专一性抑制剂毒扁豆碱和辛硫磷农药的敏感性更低，为 AChE1蛋白关键位点的突变与抗药性关系提供了理论基础，也为培育家蚕抗农药新品种和开发选择性杀虫剂提供了新的思路。　　6高通量测序研究辛硫磷诱导前后家蚕脑组织基因转录水平　　采用高通量测序技术，研究经辛硫磷（4.0μg/mL）诱导48 h后家蚕脑组织基因表达变化，从氧化代谢、核酸及氨基酸代谢等方面分析辛硫磷添毒对家蚕脑组织的影响。采用 DGE方法对对照组（CK）、添毒组（OP）两个文库进行测序，分别产生3588285，3379576个clean tag。Clean tag种类分别为67679，59278个。与基因组比对后，比对上的tag种类分别为12173和10116，分别占总clean tag种类的17.99%和17.07%。筛选家蚕添毒后脑组织中差异表达基因共315个，其中上调基因74个，下调基因241个。其中ace1的表达呈下调趋势，与我们的定量检测结果一致。线粒体相关氧化磷酸化基因上调表达，DNA损伤修复、碱基合成及代谢相关基因下调表达。透射电镜结果表明，辛硫磷诱导后细胞出现线粒体肿胀，呈空泡状、染色质结块等细胞凋亡症状，证明了辛硫磷中毒对线粒体产生损伤，对核内染色体也产生影响。为我们进一步研究家蚕及其他鳞翅目昆虫代谢及有机磷杀虫剂的分子机制打下基础。　　7辛硫磷诱导后AChE调控相关基因的转录特征　　为了研究家蚕 ace1在辛硫磷农药诱导后表达的调控作用，我们测定了辛硫磷农药诱导后AChE调控相关的5个基因（cJun-N-terminal kinase、activating transcription factor2、calpain、calcineurinA和calcineurinB）在家蚕脑组织中的转录水平。结果表明，cJun-N-terminal kinase、activating transcription factor2在辛硫磷农药诱导不同时间后，表达量都随着时间的推移呈上升状态，48 h时cJun-N-terminal kinase增加最为明显。atf2表达量在72 h时增加倍数最多。calpain、calcineurinA和calcineurinB三个基因呈先上升后下降的趋势。证明家蚕在农药诱导后，AChE调控相关的基因表达与AChE的表达存在时空差异，具有24 h的时间差，但是具体机制还有待深入研究。　　本研究首次从基因转录水平和蛋白表达水平证明辛硫磷诱导后家蚕 ace1承担重要的角色，借鉴鳞翅目抗药性害虫 AChE的突变位点，对家蚕的 ace1进行了定点突变，发现突变后对专一性抑制剂的敏感性下降，为转基因培育抗药性家蚕新品种提供了重要的育种素材。同时，对辛硫磷诱导后家蚕脑组织的基因表达谱进行了研究，分析了农药代谢相关基因的转录特征，并对ace1转录调控相关基因的转录特征进行了分析，为研究家蚕ace1的表达调控机制打下了基础。