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Abl酪氨酸激酶属于非受体酪氨酸激酶家族,结构上非常保守,其N端都包含SH3-SH2-TK结构域带,C端有肌动蛋白结合结构域[1]。脊椎动物中,Abl蛋白家族有两个成员,分别是Abl1(非受体酪氨酸激酶c-Abl)和Abl2(Abl相关基因,Arg),Abl1和Abl2 N端SH2、SH3及激酶结构域之间同源性大于90%。c-Abl参与细胞的多种生理生化过程,包括:细胞的增殖,氧化应激,DNA损伤反应,淋巴细胞的发育,细胞骨架的调节以及细胞迁移[2]。Cdc25(Cell division cycle 25)属于双特异性磷酸酶家族,能使磷酸化的丝、苏氨酸去磷酸化[3][4]。Cdc25最先在酵母中发现[5]。在人体中,Cdc25双特异磷酸酶家族由Cdc25A,B和C三个成员组成[6]。其中Cdc25C通过激活Cdc2-Cyclin B复合物从而调控细胞周期进程[3]。本研究使用免疫共沉淀和蛋白免疫印迹证实了双特异磷酸酶Cdc25C与非受体酪氨酸激酶c-Abl存在相互作用,而且其相互作用依赖c-Abl的激酶活性。c-Abl可以使Cdc25C的Y165发生酪氨酸磷酸化。Cdc25C S216位点的磷酸化促使其与14-3-3蛋白的结合,使其阻滞在细胞质中,阻碍G2/M期的转化。我们研究发现,Flag-Cdc25C/WT和Flag-Cdc25C/Y165F蛋白S216位点的磷酸化以及与14-3-3蛋白的结合没有差异,说明Y165磷酸化不影响S216磷酸化及其介导的效应。免疫印迹的研究表明,发现c-Abl过表达可导致Cdc25C在细胞内底物Cdc2Y15磷酸化增强,而c-Abl与Cdc25C突变体Y165F共转时,Cdc2 pY15的含量就没有变化,说明c-Abl可以通过磷酸化CDC25C间接调控Cdc2 Y15磷酸化。在293FT细胞过表达Flag-Cdc25C/WT与Flag-Cdc25C/Y165F,并用免疫共沉淀和亲和置换的方法纯化野生型及Y165F突变的CDC25C,纯化的蛋白与c-Abl激酶反应后用于体外的磷酸酶活性分析。结果显示,c-Abl酪氨酸激酶可显著抑制Cdc25C磷酸酶活性。我们将Flag-Cdc25C与Myc-c-Abl共转入293FT,然后纯化蛋白进行磷酸酶分析,也得到了同样的结果。然后通过CRISPR/CAS9在Hela细胞中敲除野生型CDC25C,同时通过转染恢复CDC25C野生型及CDC25C(Y165F)突变提的表达,以研究磷酸化对细胞周期等的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别Cdc25C基因第一外显子相关序列的上下游sgRNA(small guide RNA),构建真核表达质粒。测序鉴定后,将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选稳定敲除Cdc25C基因的细胞株,再用免疫印迹方法鉴定细胞Cdc25C的敲除效果。结果成功筛选出了稳定敲除Cdc25C基因的细胞株。利用病毒感染的方法将pRex-EGFP-Cdc25C野生型以及突变体倒入敲除Cdc25C基因的HeLa细胞中,用潮霉素抗性筛选,挑取单克隆,扩大培养后进行免疫印迹检测。最后成功构建了稳定表达稳定表达GFP-Cdc25C/WT和GFP-Cdc25C/Y165F的细胞株。形态上,GFP-Cdc25C/WT细胞株与Y165F存在明显的差异。GFP-Cdc25C-WT细胞株更类似空载体对照细胞,细胞棱角分明帖壁性良好,而GFP-Cdc25C-Y165F细胞株的细胞偏圆,偏小,帖壁性略差,而且细胞密度过大时一部分细胞会变圆漂浮于培养基中,漂浮的细胞传至新的培养皿中其能继续贴壁生长。用RO3306将细胞同步化至G2期。释放至普通培养基后,每隔一定时间点收取细胞,进行免疫印迹实验,我们观察到GFP-Cdc25C/YF-1、YF-2细胞株组蛋白H3 S10位磷酸化在1h达到顶峰,而GFP-Cdc25C/WT细胞株的H3 S10位磷酸化在2h内一直持续增加。免疫荧光实验也得到了与之一致的结果。这说明Cdc25C Y165F由于不能被磷酸化,一直维持在高活性的状态,一旦撤掉RO3306,Cdc25C可以迅速激活Cdc2-CyclinB,使细胞快速进入M期,完成细胞分裂。进一步,用Nocodazole将GFP-Cdc25C/WT、YF-1、YF-2、GFP-Vector四个细胞株同步到M期,释放后每隔一定的时间点收取细胞,用流式细胞仪检测细胞周期。结果显示四个细胞株在分裂期的进程上没有明显差异,这表明c-Abl调控Cdc25C Y165的磷酸化只影响G2/M期的转化,而不影响M期的进程。但是我们观察到用Nocodazole同步化后野生型与突变体所产生的多倍体存在差异,GFP-Cdc25C/YF多倍体(8N)细胞的数量明显高于GFP-Cdc25C/WT细胞株。说明GFP-Cdc25C/WT对维持基因组稳定性上具有重要作用。离子辐射会造成细胞DNA损伤,并激活ATM/ATR-Chk1/Chk2-Cdc25C信号通路,引起G2/M期的阻滞[7]。将GFP-Cdc25C/WT、YF-1、YF-2细胞株进行离子辐射处理,其中GFP-Cdc25C/YF-1、YF-2能更迅速的通过G2/M期阻滞。这也提示由于GFP-Cdc25C/YF-1、YF-2细胞株中Cdc25C维持较高的活性,导致细胞提前通过G2期检查点。综上所述,我们的研究发现c-Abl能与Cdc25C相互作用,并且磷酸化其Y165。Y165位的磷酸化会降低Cdc25C磷酸酶的活性,c-Abl能通过Cdc25C调控G2/M期转换。卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌和非霍奇金淋巴瘤等肿瘤细胞中Cdc25维持高活性或高表达的状态[3][6]。我们研究表明应答细胞损伤时,突变体细胞株能提早地通过G2检查点,因此可能会影响基因组的完整性和稳定性。这提示我们c-Abl调控Cdc25C的信号通路可能与癌症发生密切相关。