怀孕母畜流产是布鲁氏菌侵染宿主后所引发的最主要的并发症。滋养层细胞是除单核-巨噬细胞外布鲁氏菌侵染的主要靶细胞,子宫内膜上皮细胞是与滋养层细胞在结构和功能上密切相关的细胞。研究证实布鲁氏菌在宿主细胞内的侵染、增殖与内质网(Endoplasmic reticulum,ER)密切相关,布鲁氏菌能够利用内质网作为其在细胞内的增殖部位,从而逃避宿主免疫系统的杀伤。内质网也是细胞内各种蛋白质合成、运输、分泌的主要场所,对于维持细胞稳态具有重要作用。当细胞的稳态因为病原菌的感染而被打破,就会引发宿主细胞发生内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress,ER stress)和未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)来恢复细胞的正常功能。布鲁氏菌进入宿主细胞后ERA-BCV(Endoplasmic reticulum associated-Brucella containing vacuoles)的形成和宿主细胞凋亡的抑制是其逃避杀伤、进而生存和增殖的关键。内质网平衡缺失引起的ER stress是诱发细胞凋亡的重要途径之一。然而,内质网应激在布鲁氏菌侵染怀孕母畜子宫并引起怀孕母畜流产的机制至今尚不清楚。本研究利用猪布鲁氏菌S2株(Brucella suis strain 2,B.suis S2)体外感染山羊滋养层细胞和子宫内膜上皮细胞,利用内质网应激通路相关的各种抑制剂、激活剂和免疫荧光,基因的过表达和沉默,荧光定量RT-PCR,流式细胞术,Western Blot等相关的实验技术来探索(1)布鲁氏菌S2株对山羊滋养层细胞和子宫内膜上皮细胞的侵染能力;(2)布鲁氏菌S2株增殖对山羊滋养层细胞和子宫内膜上皮细胞凋亡的影响;(3)布鲁氏菌S2株增殖对山羊滋养层细胞和子宫内膜上皮细胞ER stress的激活;(4)操控滋养层细胞内质网应激状态对布鲁氏菌S2株增殖的影响;(5)布鲁氏菌S2株增殖对山羊滋养层细胞和子宫内膜上皮细胞生物活性的影响。1.通过激光共聚焦显微镜及菌落计数的方法,发现布鲁氏菌S2株无论是对亲嗜性的滋养层细胞还是非亲嗜性的子宫内膜上皮细胞都表现出一定的感染性,且在这两种细胞内随着感染时间增加具有明显的增殖现象。2.通过流式细胞术、免疫荧光、Western Blot和荧光定量PCR的方法,发现布鲁氏菌S2株感染不同的细胞对其损害程度不同,对于其靶细胞滋养层的侵染能够引起宿主细胞的凋亡并且伴发相应的细胞凋亡信号分子的表达。而对于其非靶细胞山羊子宫内膜上皮细胞的侵染,并没有引起山羊子宫内膜上皮细胞的凋亡和相应的凋亡信号分子的显著改变。因此,布鲁氏菌侵染对滋养层细胞的损害可能是引发流产的主要原因。3.通过免疫荧光、Western Blot和荧光定量PCR的方法,发现布鲁氏菌S2株无论是在亲嗜性的滋养层细胞还是在非亲嗜性的子宫内膜上皮细胞内增殖过程中,都激发了宿主细胞相应的内质网应激反应。然而,激活的UPR通路不同,最主要的原因是不同宿主细胞对布鲁氏菌侵染所表现出的抵抗力不同。4.通过免疫荧光、Western Blot和荧光定量PCR的方法,利用内质网应激激活剂(Tm)、抑制剂(4-PBA),IRE1抑制剂(Irestatin 9389),自噬抑制剂(氯喹)和GRP78基因过表达和沉默等操控内质网应激诱发的宿主细胞凋亡反应和自噬反应影响到了布鲁氏菌S2株在滋养层细胞内的增殖,然而仅仅影响滋养层细胞内IRE1α蛋白表达对布鲁氏菌S2株的在滋养层细胞内增殖没有显著地影响。5.利用山羊胎盘滋养层细胞和子宫内膜上皮细胞共培养及孕激素的联合使用,体外构建了山羊妊娠子宫模型,发现布鲁氏菌S2株对妊娠子宫体外模型侵染的过程中,主要通过打破滋养层细胞的内分泌平衡和子宫内膜上皮细胞的容受性而不是损害滋养层细胞的迁移和侵袭能力来引起妊娠母畜的流产和早产,这一过程同样伴随着内质网应激反应的发生。以上结果表明,内质网应激在布鲁氏菌S2株体外感染山羊子宫内膜上皮细胞和滋养层细胞过程中起着重要的作用,布鲁氏菌S2株在山羊子宫内膜上皮细胞和滋养层细胞内的增殖激活了不同的ER stress-UPR通路。宿主内质网应激相关的细胞凋亡和自噬反应影响了布鲁氏菌S2株在滋养层细胞内的增殖。此外,布鲁氏菌S2株在侵染并激活山羊子宫内膜和滋养层细胞内质网应激的同时,损害了滋养层细胞的内分泌平衡和子宫内膜上皮细胞的容受性。本研究从病原入侵,内质网应激和生殖内分泌角度探索了布鲁氏菌侵染导致流产的部分机制。我们的研究结果将为完善布鲁氏菌感染的调控机理提供新的理论依据。同时为全面认识布鲁氏菌导致不育、流产的机制提供依据。