缺血性脑卒中已成为我国高发病率、高致残率、高死亡率等的主要原因。对于缺血性脑卒中而言,最有效治疗措施就是及早恢复缺血区血流供应,可及时挽救缺血半暗带的脑组织。其中,静脉性药物溶栓、血管内介入治疗是目前国际上公认的急性缺血性脑卒中的主要治疗方式。尽管部分供血障碍的责任血管经过这两种方法治疗后得到再通,然而,临床发现有些患者临床症状并未得到改善,并出现脑水肿、出血转化等,随之脑组织功能进一步加重或恶化,这一现象称为脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤的发生机制较为复杂,其中炎症和内质网应激对脑缺血再灌注损伤的发生和发展起着关键的作用。近年研究发现,内质网应激与炎症反应之间存在着广泛的联系,内质网应激可通过未折叠蛋白反应跨膜感受器信号通路与炎症反应通路偶联,从而参与多种炎症性疾病的病理生理过程。内质网应激及其偶联的相关炎性通路在脑缺血再灌注损伤中可能发挥重要作用。因此,探寻脑缺血再灌注损伤发生过程中内质网应激相关炎性通路并对其加以调控,可能为缺血再灌注损伤的治疗提供新的方向。TSG-6是一种炎症相关的分泌蛋白,具有重要而多样的抗炎特性和组织保护作用。在阿尔茨海默病、蛛网膜下腔出血、创伤性脑损伤、炎症性脑损伤等中枢神经系统疾病中,TSG-6可改善神经功能的缺损、减轻血脑屏障的破坏等从而发挥神经保护的作用。且TSG-6可明显减轻脑梗死大鼠的神经功能缺损。由此提示,TSG-6对脑缺血再灌注损伤可能同样具有神经保护作用。本研究正是基于上述理论,本研究拟采用脑缺血再灌注损伤大鼠模型,观察TSG-6对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用,并探讨内质网应激-炎症反应信号通路在TSG-6对脑缺血再灌注损伤治疗过程中的可能的作用机制。第一部分 TSG-6减轻脑缺血再灌注后大鼠神经元损伤及血脑屏障的破坏目的:观察TSG-6对脑缺血再灌注后大鼠神经元损伤及血脑屏障的破坏的保护作用。方法:建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,同时设置假手术组为对照（Sham）,在再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h取半影区（Ischemic）脑组织样本,随后采用ELISA法检测TSG-6表达水平的变化;此外,为确认脑缺血再灌注损伤后内质网应激水平的变化,采用Western blot法检测大鼠再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h不同时间点内质网应激相关蛋白Bip、p-PERK和p-IRE1α的表达水平;依据TSG-6及内质网应激相关蛋白的表达变化,选择再灌注时间进行后续实验的研究和观察。随后,利用脑立体定位仪对大鼠进行侧脑室定位,然后分别将不同剂量的TSG-6（1、5和10μg）注射进大鼠右侧梗死区侧脑室中。30分钟后建立大鼠脑缺血再灌注模型（CIR）,再灌注24 h,我们观察假手术组（Sham）、模型组（CIR）、模型+低剂量TSG-6组（1μg）、模型+中剂量TSG-6组（5μg）和模型+高剂量TSG-6组（10 μg）大鼠神经功能缺损评分;TTC染色观察各组大鼠的脑梗死体积;干湿重法检测大鼠病灶侧脑组织的含水量;伊文思蓝染色法（EB）测定伊文思蓝的渗出情况;HE染色观察大鼠脑缺血再灌注后24小时脑组织形态学变化;尼氏染色计算完整神经元的数目,进一步量化神经元损伤的程度;TUNEL染色检测神经细胞凋亡情况。结果:（1）TSG-6的表达情况:相对于对照组大鼠,造模后的半影区大脑皮质中TSG-6的表达在再灌注6 h迅速提升,再灌注24 h达到高峰,随后再灌注48 h、72 h逐渐下降;但模型组（CIR）再灌注不同时间点TSG-6表达水平均较对照组显著上调,两相比较均具有统计学意义（P＜0.05）。（2）内质网应激蛋白Bip、p-PERK和p-IRE1α的表达情况:相对于对照组（Sham）大鼠,造模后的半影区大脑皮质中Bip、p-PERK和p-IRE1α的表达在再灌注6h迅速提升,再灌注24 h达到高峰,随后再灌注48 h、72 h逐渐下降;但模型组（CIR）再灌注不同时间点Bip、p-PERK和p-IRE1α表达水平均较对照组显著上调,两相比较均具有统计学意义（P＜0.05）。（3）神经功能评分:模型组（CIR）大鼠神经功能评分较假手术组（Sham）明显降低,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）;中剂量TSG-6组（5μg）和高剂量TSG-6组（10μg）大鼠则较模型组（CIR）大鼠神经功能评分明显增加,两相比较均具有统计学意义（P＜0.05）,其中高剂量TSG-6组（10μg）大鼠神经功能评分升高更显著。（4）TTC染色:模型组（CIR）大鼠脑组织染色后,缺血侧呈现明显的白色梗死区域,与假手术组（Sham）相比差异显著,具有统计学意义（P＜0.05）;中剂量TSG-6组（5μg）和高剂量TSG-6组（10 μg）大鼠脑组织染色后缺血侧梗死体积较模型组（CIR）大鼠明显缩小,两相比较均具有统计学意义（P＜0.05）,其中高剂量TSG-6组（10μg）大鼠缺血侧梗死体积缩小更明显。（5）脑组织含水量:模型组（CIR）大鼠病灶侧脑组织含水量较假手术组（Sham）大鼠明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;中剂量TSG-6组（5μg）和高剂量TSG-6组（10μg）大鼠病灶侧脑组织含水量则较模型组（CIR）大鼠明显减少,两相比较均具有统计学意义（P＜0.05）,其中高剂量TSG-6组（10 μg）大鼠病灶侧脑组织含水量减少更明显。（6）伊文思蓝染色（EB）:模型组（CIR）大鼠伊文思蓝渗出较假手术组（Sham）大鼠明显增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）;中剂量TSG-6组（5μg）和高剂量TSG-6组（10μg）大鼠伊文思蓝渗出则较模型组（CIR）大鼠明显减少,两相比较均具有统计学意义（P＜0.05）,其中高剂量TSG-6组（10 μg）大鼠伊文思蓝渗出减少更加明显。（7）HE染色:假手术组（Sham）大脑皮层神经元细胞未见明显病理损害;模型组（CIR）大鼠神经细胞排列异常紊乱,细胞与细胞之间的间隙变宽且分界欠清,形态结构出现异常,胞体萎缩,胞浆松散,出现空泡,胞核可见固缩及深染;最适剂量TSG-6组（10μg）大鼠较模型组（CIR）大鼠大脑皮层神经元和组织结构的损伤程度及数量明显减轻,病理损害获得显著改善。（8）尼氏染色（Nissl）:假手术组（Sham）大鼠可见丰富的尼氏小体,未见明显损害;模型组（CIR）大鼠尼氏小体数量极度减少,较假手术组（Sham）大鼠明显减少,差异具有统计学意义（P＜0.05）;最适剂量TSG-6组（10μg）大鼠尼氏小体数量则较模型组（CIR）大鼠明显增加,颜色较深,两相比较均具有统计学意义（P＜0.05）。（9）TUNEL染色:模型组（CIR）大鼠细胞凋亡指数较假手术组（Sham）大鼠明显增多,差异具有统计学意义（P＜0.05）;最适剂量TSG-6组（10μg）大鼠细胞凋亡指数则较模型组（CIR）大鼠明显减少,两相比较均具有统计学意义（P＜0.05）,其中高剂量TSG-6组（10μg）大鼠细胞凋亡指数减少更加明显。小结:1.侧脑室注射TSG-6可减轻脑缺血再灌注损伤后大鼠的神经功能受损。2.侧脑室注射TSG-6可有效地缩小脑缺血再灌注损伤后大鼠的脑梗死体积。3.侧脑室注射TSG-6可减轻脑缺血再灌注损伤后大鼠大脑皮层神经元和组织结构的损伤程度及数量,显著改善其病理损害。4.侧脑室注射TSG-6可有效地减少脑缺血再灌注损伤后大鼠尼氏小体的丢失,显著抑制脑缺血再灌注大鼠神经元的损害。5.侧脑室注射TSG-6可有效地抑制脑缺血再灌注损伤后大鼠神经细胞的凋亡,从而发挥神经保护作用。6.侧脑室注射TSG-6可减轻脑缺血再灌注损伤大鼠的血脑屏障（BBB）通透性和脑水肿。第二部分 TSG-6抑制大鼠脑缺血再灌注损伤诱导的内质网应激（ERS）反应及其PERK和IRE1α信号传导通路和炎症反应目的:观察TSG-6对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经元的内质网应激（ERS）反应及其PERK和IRE1α下游信号传导通路的相关蛋白的表达情况和大鼠脑缺血再灌注损伤后神经元的炎症反应的变化情况。方法:利用脑立体定位仪对大鼠进行侧脑室定位,将TSG-6（10μg）注射进大鼠右侧梗死区侧脑室中。30分钟后建立大鼠脑缺血再灌注模型（CIR）,将大鼠随机分为假手术组（Sham）、模型组（CIR）和模型+TSG-6（10μg）（TSG）组,再灌注24 h,取半影区（Ischemic）脑组织样本,采用Western blot和免疫荧光双标染色法检测内质网应激反应的相关蛋白的表达水平。Western blot法检测内质网应激反应PERK和IRE1α下游信号传导通路的相关蛋白的表达情况。采用ELISA法检测炎症反应相关因子。结果:（1）内质网应激（ERS）反应的变化情况:模型组（CIR）大鼠大脑皮层神经元中Bip、p-PERK和p-IRE1α表达水平较假手术组（Sham）大鼠明显上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）;TSG（10μg）组大鼠大脑皮层神经元中Bip、p-PERK和p-IRE1α表达水平则较模型组（CIR）大鼠显著降低,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）。模型组（CIR）大鼠大脑皮层神经元中p-PERK和p-IRE1α（p-PERK染色呈绿色,p-IRE1α呈红色）荧光强度较假手术组（Sham）大鼠明显增强,差异具有统计学意义（P＜0.05）;TSG（10μg）组大鼠大脑皮层神经元中p-PERK和p-IRE1α荧光强度则较模型组（CIR）大鼠显著降低,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）。（2）内质网应激反应PERK和IRE1α下游信号分子的变化情况:模型组（CIR）大鼠大脑皮层神经元中eIF-2α、p-eIF-2α、TRAF2和NF-κB p65表达水平较假手术组（Sham）大鼠明显上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）;TSG（10μg）组大鼠大脑皮层神经元中eIF-2α、p-eIF-2α、TRAF2和NF-κBp65表达水平则较模型组（CIR）大鼠显著降低,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）。（3）炎症反应:模型组（CIR）大鼠大脑皮层神经元中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平较假手术组（Sham）大鼠明显上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）;TSG（10μg）组大鼠大脑皮层神经元中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平则较模型组（CIR）大鼠显著降低,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）。小结:1.侧脑室注射TSG-6可抑制脑缺血再灌注损伤后大鼠的内质网应激相关蛋白Bip（GRP78）、p-PERK 和 p-IRE1α的表达。2.侧脑室注射TSG-6可有效地抑制大鼠脑缺血再灌注损伤诱导的内质网应激PERK和IRE1α信号传导通路及其下游信号分子的表达,即PERK-eIF-2α、IRE1α-TRAF2 和 NF-κB p65。3.侧脑室注射TSG-6对大鼠脑缺血再灌注损伤诱导的炎症反应具有明显的抑制作用。第三部分 脑缺血再灌注损伤中内质网应激可通过PERK-eIF-2α-NF-κB p65和IRE1α-TRAF2-NF-κB p65信号通路触发炎症反应目的:探讨大鼠脑缺血再灌注损伤中神经元内质网应激反应（ERS）与炎症反应之间的内在联系。方法:利用脑立体定位仪对大鼠进行侧脑室定位,将特异性内质网应激（ERS）抑制剂（4-PBA）、PERK抑制剂（GSK2656157）和 IRE1α抑制剂（STF083010）注射进大鼠右侧梗死区侧脑室中。30分钟后建立大鼠脑缺血再灌注模型（CIR）,将大鼠随机分为假手术组（Sham）、模型组（CIR）、模型+内质网应激（ERS）抑制剂组（4-PBA）、模型+PERK抑制剂组（GSK）和模型+IRE1α抑制剂组（STF）5组,再灌注24 h后,取半影区（Ischemic）脑组织样本,随后采用Western blot法检测内质网应激反应PERK、IRE1α及其下游信号传导通路的相关蛋白。ELISA法检测大鼠脑缺血再灌注损伤中神经元炎症反应相关因子。结果:（1）模型组（CIR）大鼠大脑皮层神经元中PERK、IRE1α、eIF-2α、p-eIF-2α、TRAF2和NF-κB p65表达水平较假手术组（Sham）大鼠明显上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）;内质网应激（ERS）抑制剂组（4-PBA）大鼠,其大脑皮层神经元中PERK、IRE1α、eIF-2α、p-eIF-2α、TRAF2 和 NF-κB p65 表达水平较模型组（CIR）大鼠明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）;PERK抑制剂组（GSK）大鼠,其大脑皮层神经元中PERK、eIF-2α、p-eIF-2α和NF-κB p65表达水平较模型组（CIR）大鼠明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）;IRE1α抑制剂组（STF）大鼠,其大脑皮层神经元中IRE1α、TRAF2和NF-κB p65表达水平较模型组（CIR）大鼠明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（2）炎症反应:模型组（CIR）大鼠大脑皮层神经元中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平较假手术组（Sham）大鼠明显上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）;内质网应激（ERS）抑制剂组（4-PBA）大鼠,其大脑皮层神经元中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平较模型组（CIR）大鼠明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）;PERK抑制剂组（GSK）大鼠,其大脑皮层神经元中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平较模型组（CIR）大鼠明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）;IRE1α抑制剂组（STF）大鼠,其大脑皮层神经元中IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平较模型组（CIR）大鼠明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。小结:1.内质网应激（ERS）抑制剂（4-PBA）不仅可抑制大鼠脑缺血再灌注损伤诱导的PERK和IRE1α信号传导通路及其下游信号分子的表达,即PERK-eIF-2α、IRE1α-TRAF2和NF-κB p65,且可有效抑制大鼠脑缺血再灌注损伤神经元炎症反应。2.PERK抑制剂GSK2656157可显著抑制内质网应激PERK-eIF-2α通路,从而下调NF-κB p65活性,借此降低IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平。3.IRE1α抑制剂组STF083010可显著抑制内质网应激IRE1α-TRAF2通路,从而下调NF-κB p65活性,借此降低IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平。4.上述研究结果表明在大鼠脑缺血再灌注损伤中内质网应激（ERS）可通过PERK-eIF-2α-NF-κB p65 和 IRE1α-TRAF2-NF-κB p65 信号通路触发炎症反应。第四部分 TSG-6通过抑制内质网应激PERK和IRE1α介导的炎症反应信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤及血脑屏障破坏目的:探讨TSG-6介导的大鼠脑缺血再灌注损伤及血脑屏障破坏保护中所涉及的信号通路。方法:利用脑立体定位仪对大鼠进行侧脑室定位,然后分别将不同剂量的TSG-6（10μg）和特异性内质网应激激活剂衣霉素Tunicamycin（TM）注射进大鼠右侧梗死区侧脑室中。30分钟后建立大鼠脑缺血再灌注模型（CIR）,再灌注24 h,我们观察假手术组（Sham）、模型组（CIR）、模型+TSG-6（10 μg）（TSG）组,和模型+TSG（10μg）+内质网应激激活剂组（TM）组大鼠神经功能缺损评分;TTC染色观察各组大鼠的脑梗死体积;干湿重法检测大鼠病灶侧脑组织的含水量;伊文思蓝染色法（EB）测定伊文思蓝的渗出情况;尼氏染色计算完整神经元的数目,进一步量化神经元损伤的程度;TUNEL染色检测神经细胞凋亡情况。结果:（1）神经功能评分:模型组（CIR）大鼠神经功能评分较假手术组（Sham）明显降低,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）;TSG-6组（10μg）大鼠则较模型组（CIR）大鼠神经功能评分明显升高,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）;而TM组大鼠则较TSG-6组（10μg）大鼠神经功能评分明显降低,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）。（2）TTC染色:模型组（CIR）大鼠脑组织缺血侧呈现明显的白色梗死区域,与假手术组（Sham）相比差异显著,具有统计学意义（P＜0.05）;TSG-6组（10 μg）大鼠脑组织缺血侧梗死体积较模型组（CIR）大鼠明显缩小,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）;而TM组大鼠脑组织缺血侧梗死体积则较TSG-6组（10μg）大鼠明显增加,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）。（3）脑组织含水量:模型组（CIR）大鼠病灶侧脑组织含水量较假手术组（Sham）大鼠明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;TSG-6组（10μg）大鼠病灶侧脑组织含水量则较模型组（CIR）大鼠明显减少,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）;而TM组大鼠病灶侧脑组织含水量则较TSG-6组（10 μg）大鼠明显增加,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）。（4）伊文思蓝染色（EB）:模型组（CIR）大鼠伊文思蓝渗出较假手术组（Sham）大鼠明显增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）;TSG-6组（10μg）大鼠伊文思蓝渗出则较模型组（CIR）大鼠明显减少,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）;而TM组大鼠伊文思蓝渗出则较TSG-6组（10μg）大鼠明显增加,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）。（5）尼氏染色（Nissl）:模型组（CIR）大鼠尼氏小体数量较假手术组（Sham）大鼠明显减少,差异具有统计学意义（P＜0.05）;TSG-6组（10μg）大鼠尼氏小体数量则较模型组（CIR）大鼠明显增加,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）;而TM组大鼠尼氏小体数量则较TSG-6组（10μg）大鼠明显减少,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）。（6）TUNEL染色:模型组（CIR）大鼠凋亡细胞数量较假手术组（Sham）大鼠明显增多,差异具有统计学意义（P＜0.05）;TSG-6组（10μg）大鼠细胞凋亡指数则较模型组（CIR）大鼠明显减少,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）;而TM组大鼠细胞凋亡指数则较TSG-6组（10μg）明显增加,两相比较具有统计学意义（P＜0.05）。小结:1.内质网应激激活剂衣霉素（TM）逆转了 TSG-6对神经功能评分、梗死体积、脑水肿、BBB通透性、组织病理学改变和细胞凋亡的作用,即内质网应激激活剂衣霉素（TM）逆转了 TSG-6对大鼠脑缺血再灌注神经元损伤及血脑屏障破坏的保护作用。2.上述研究结果表明,TSG-6可有效地抑制大鼠脑缺血再灌注损伤诱导的内质网应激PERK和IRE1α信号传导通路及其下游信号分子的表达,即PERK-eIF-2α、IRE1α-TRAF2和NF-κB p65;且TSG-6对大鼠脑缺血再灌注损伤诱导的炎症反应具有明显的抑制作用,类似于特异性内质网应激（ERS）抑制剂（4-PBA）、PERK抑制剂（GSK2656157）和IRE1α抑制剂（STF083010）对大鼠脑缺血再灌注损伤中炎症因子的作用;因此,我们推测TSG-6通过内质网应激PERK和IRE1α介导的炎症反应信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤及血脑屏障的破坏。且内质网应激激活剂衣霉素（TM）逆转了 TSG-6对大鼠脑缺血再灌注损伤及血脑屏障破坏的保护作用,从而证实TSG-6通过抑制内质网应激PERK和IRE1α介导的炎症反应信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤及血脑屏障破坏。结论:1.TSG-6可减轻脑缺血再灌注后大鼠神经元损伤及血脑屏障的破坏,发挥神经保护作用。2.TSG-6可抑制大鼠脑缺血再灌注损伤诱导的内质网应激（ERS）反应、PERK-eIF-2α-NF-κB p65和IRE1α-TRAF2-NF-κB p65信号通路及其触发的炎症反应。3.TSG-6通过抑制内质网应激PERK和IRE1α介导的炎症反应信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤及血脑屏障破坏。