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目的:探讨2,5-己二酮对VSC4.1细胞自噬的诱导作用及其分子机制。材料和方法:用含有15%FBS的DMEM预处理VSC4.1细胞24 h。然后将细胞分为四组:(1)空白对照组:不对VSC4.1细胞进行任何处理;(2)HD暴露组:将VSC4.1细胞暴露于0 m M、5 m M、15 m M和25 m M HD中,培养24 h;(3)自噬抑制剂组:用0 m M、25 m M HD处理VSC4.1细胞24 h后,分别加入5μM PIK-III,继续培养24 h;(4)激动剂组:用25 m M HD单独处理VSC4.1细胞24 h后,分别加入30μM 740Y-P、14μM SC79和120μM 3BDO处理VSC4.1细胞12 h。LC3-DAPI免疫荧光双染法检测VSC4.1细胞自噬;用电镜来检测细胞的自噬体;WesternBlotting检测细胞中LC3、p62、Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR、ULK1和p-ULK1的表达;LDH检测细胞死亡率;用SPSS13.0统计软件对实验的所有结果进行分析。结果:HD诱导VSC4.1细胞过度自噬:LC3-DAPI荧光双染检测细胞自噬时,发现随着HD浓度增加,LC3病灶细胞数量显著增多(p<0.05)。电镜法观察细胞自噬体,随着HD浓度增加,自噬体的数量显著增多(p<0.05)。Western-Blotting检测细胞中蛋白表达,随着HD浓度增加,LC3-II/I表达比值显著增多(p<0.05),p62蛋白表达量显著降低(p<0.05);HD诱导VSC4.1细胞自噬性死亡:LDH法检测细胞死亡率,随着HD浓度增加,细胞死亡率显著增加(p<0.05),PIK-III干预组显著低于HD组(p<0.05)。Pearson相关分析,随着HD浓度增加,细胞死亡率与LC3病灶细胞数量呈线性相关。LC3-DAPI荧光双染检测细胞自噬,HD组LC3病灶细胞数量显著增多,而PIK-III干预组显著减少(p<0.05)。Western-Blotting检测细胞中蛋白表达,HD组的LC3-II/I表达比值显著高于Control组(p<0.05),PIK-III干预组显著低于HD组(p<0.05);HD对VSC4.1细胞Akt磷酸化水平影响:Western-Blotting检测细胞中蛋白表达,随着HD浓度增加,p-Akt的蛋白表达量显著降低(p<0.05),740Y-P干预组显著高于HD组(p<0.05),而Akt的蛋白表达水平在各组间都没有差异(p>0.05);HD对VSC4.1细胞m TOR磷酸化水平影响:Western-Blotting检测细胞中蛋白表达,随着HD浓度增加,p-m TOR的蛋白表达量显著降低(p<0.05),740Y-P和SC79干预组显著高于HD组(p<0.05),而m TOR的蛋白表达水平在各组间都没有差异(p>0.05);HD对VSC4.1细胞ULK1磷酸化水平影响:Western-Blotting检测细胞中蛋白表达,随着HD浓度增加,p-ULK1的蛋白表达显著降低(p<0.05),SC79和3BDO干预组显著高于HD组(p<0.05),而ULK1的蛋白表达水平在各组间都没有差异(p>0.05);HD通过PI3K/Akt/m TOR信号对VSC4.1细胞自噬的影响:LC3-DAPI荧光双染检测细胞自噬,HD组LC3病灶细胞数量显著增多(p<0.05),而740Y-P、SC79和3BDO干预组显著减少(p<0.05)。电镜法观察自噬体的数量,HD组的自噬体数量显著增多(p<0.05),而740Y-P、SC79和3BDO干预组则明显减少(p<0.05)。Western-Blotting检测细胞中蛋白表达,HD组的LC3-II/I表达比值显著高于Control组(p<0.05),740Y-P、SC79和3BDO干预组显著低于HD组(p<0.05)。p62蛋白表达量在HD组显著低于Control组(p<0.05),740Y-P、SC79和3BDO干预组显著高于HD组(p<0.05)。结论:HD以剂量依赖性方式诱导VSC4.1细胞过度自噬;HD诱导VSC4.1细胞自噬性死亡;HD诱导VSC4.1细胞过度自噬与PI3K/Akt/m TOR信号通路抑制有关。