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Methuselah(Mth)在果蝇中被鉴定为GPCR-B家族成员,被报道与其内源性配体Stunted参与调控果蝇的发育、寿命、生殖和应激能力。迄今研究发现mth仅存在于果蝇属,而在其他昆虫中都只有其同源基因mth-like(mthl)存在。但是这些mthls的功能与mth有何异同尚不清楚,而且Mth/Stunted的信号通路及其调控机制还有待深入研究。前期研究显示在不同昆虫中分别存在3～5个mthls基因,它们被分为3个mthl亚群,其中赤拟谷盗(Tribolium castaneum)5个mthls基因分属于这三个亚群,对其研究能有效的反应mthls基因的功能及可能的分化机制。而且这5个mthls(mthl1～mthl5)基因在赤拟谷盗各个发育时期都有表达,但是它们之间却呈现较大的表达差异。为了进一步探讨赤拟谷盗mthls的功能及调控机制,通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)分析显示mthl1对赤拟谷盗胚胎、幼虫和蛹的发育、羽化和产卵量有重要的调节作用,mthl2则主要影响赤拟谷盗成虫羽化和产卵量,mthl4是胚胎发育必需的基因,但是mthl3和mthl5对赤拟谷盗发育和生殖没有明显作用。晚期蛹RNAi抑制这5个mthls基因的表达均降低赤拟谷盗成虫对饥饿的抵抗能力;和对照组相比,mthl1和mthl2RNAi组成虫的热抵抗能力明显下降;而mthl4和mthl5RNAi组的成虫增强了抗氧化能力。我们的结果还显示敲低mthls(mthl1,mthl2,mthl4和mthl5)的表达显著缩短了赤拟谷盗成虫的寿命,与mth在果蝇中的作用相反。所有这些结果表明mthls之间或mthls与mth都发生了功能分化。上述结果显示赤拟谷盗mthls(Tcmthl1)在生长、发育和生殖方面有重要的作用,为阐明TcMthl1的调控机制,我们利用RNA-sequencing的方法分析了其下游关联基因及通路。通过测序从ds-Tcmthl1和control组幼虫13,533个基因中鉴定出 812 个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),包括 352 个上调表达基因,460下调表达个基因。这些差异表达基因分属于47个功能组中,其中涉及免疫、刺激、发育和生殖等生物学过程。在这些差异表达基因中,敲低Tcmthl1显著下调Toll和spatzle(spz)4,5和6的表达却使dorsal的表达上调,进而抑制了 Toll信号通路的活力;测序结果还显示PGRP-LB的表达被显著上调会导致IMD信号通路失活,因此敲低Tcmthll降低了赤拟谷盗的先天免疫力,并通过“cross-talk”影响寿命和应激能力。另外,差异表达基因B lymphocyte-induced maturation protein 1(blimp-l),ftz-f1 E74 和 timeless 参与调控ds-Tcmthll组赤拟谷盗的发育和生殖。出乎意料的是Tcmthll RNAi显著降低了赤拟谷盗stunted的表达。为阐明Stunted在TcMthll信号通路中的作用,我们利用RNAi和RNA-sequencing方法分析了赤拟谷盗Stunted的功能及信号通路。RNAi敲低stunted不仅使赤拟谷盗幼虫发育停滞,而且还导致蜕皮、化蛹和羽化缺陷。RNA-sequencing显示stunted敲低导致1,293个基因表达出现显著差异,包括737个基因上调表达,556个基因下调表达。在这些基因中,敲低stunted上调了催化蜕皮激素(20-hydroecdysone,20E)发生26-羟基化的关键酶基因CYP18A1的表达,下调了调控胆固醇转变为20E的基因ftz-f1声的表达;并且还降低20E应答基因Broad-complex(Br-C)和E74的表达。另一方面,敲低stunted使保幼激素(juvenilehormone,JH)信号通路关键基因kruppel-homolog 1(Kr-h1)的表达上调。这些结果表明stunted通过影响20E和JH信号通路的活力来调控赤拟谷盗的变态行为。敲低Tcmthl1和stunted均下调了dusky(dy)和dusky-like(dy/)的表达。为了阐明dy和dyl的功能及其在TcMthl1和Stunted信号通路中作用,我们在赤拟谷盗中对它们进行了 RNAi。结果显示dy在赤拟谷盗翅膀形态发生有重要调控作用,而dy/是赤拟谷盗幼虫表皮色素分散和变态所必需的基因。进一步研究发现dy正调控forked和four-jointed(fj)来调控赤拟谷盗翅膀的形态发生,而dyl在赤拟谷盗中的表达是blimp-1通过shavenbnbaby(svb)调控实现的,但是它却可以调节ftz-fl的表达来影响赤拟谷盗的变态行为。这些结果表明TcMthll和Stunted通过Dy和Dyl调控赤拟谷盗生长和发育。本研究在赤拟谷盗中利用RNAi技术揭示了mthl和s unted的功能,结合RNA-sequencing初步探讨了它们的信号通路,为全面解析Mthl和Stunted的信号通路提供了重要信息;因mthl和stunted对赤拟谷盗生长、发育的具有重要影响,对其功能和信号传导系统的研究还可能鉴定新的杀虫剂作用靶标,同时为害虫的生物学防治打下基础。