研究背景霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma,HL)在1832年被Thomas Hodgkin第一次描述,182年来它的发病机制一直笼罩在神秘之中,因为该瘤是组织形态非常特殊的一类淋巴瘤,它的肿瘤细胞-H/RS(Hodgkin/Reed-Sternberg)细胞在肿瘤实质中所占比例非常低,约为1/100,在淋巴细胞丰富型中甚至只占到1/1000。直到14年前,Kuppers等通过单细胞分析结合IgH基因重排才证实它来源于B细胞。HL背景中的混合性炎细胞(包括T细胞、B细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞等)及其细胞因子是H/RS细胞生存的基础条件。已有证据表明H/RS细胞生存明显依赖其周围细胞释放的生存信号：背景细胞死亡,H/RS细胞消亡,因此原发肿瘤的H/RS细胞体外极难培养；HL初发在淋巴结,建立H/RS细胞与背景细胞共同存在的细胞系,模拟淋巴结内肿瘤状态及生存环境,则是理想的细胞系；但是H/RS细胞与背景细胞共同培养时,一方面因H/RS细胞数量少,另一方面因背景细胞容易死亡,建系无法完成,所以目前建立的细胞系屈指可数,且均无一来自淋巴结的瘤细胞,而是来自晚期HL患者的外周血、骨髓或腹水,这些细胞系不能模拟淋巴结内肿瘤状态,但提示HL晚期时H/RS细胞可以离开淋巴结生存,而早期HL患者周围血液中很少发现H/RS细胞；当H/RS细胞转移到其它器官中,背景细胞依然类似淋巴结内病变；H/RS细胞在异种移植的免疫正常小鼠或轻度免疫缺陷小鼠中很难生存(免疫排斥所致),H/RS细胞移植到严重免疫缺陷小鼠可以存活与增生,却已丧失HL的固有组织形态与生活环境。T淋巴细胞在维持H/RS细胞存活当中起着至关重要的作用：肿瘤细胞同T细胞之间通过某些细胞因子相互作用得以共生,以此营造了H/RS细胞适宜的生存环境。在众多的细胞因子中哪些是最重要的?可借助生物信息学方法找出关键的细胞因子,通过上调这种关键细胞因子的作用,以利于动物模型在成瘤过程中能募集更多的背景细胞,达到真正接近HL模型。因此本研究前期借助生物信息学方法利用公共芯片数据资源以及相关软件对其进行分析,简捷而高效地揭示出H/RS细胞同周围背景T淋巴细胞非常复杂的网络关系。HL肿瘤细胞-H/RS细胞能募集大量T细胞在其周边,而一般B细胞淋巴瘤的瘤细胞周围仅见少量散在T细胞,鉴于两者在背景T细胞方面的巨大差异,分析设计以B细胞淋巴瘤作为对照,利用GeneSifter在线软件和BRB-Array Tools对公共基因芯片数据库GEO(Gene Expression Omnibus)中的HL细胞株L428细胞同B细胞淋巴瘤Burkitt细胞株Raji细胞、HL病人瘤组织分离H/RS细胞同弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)病人瘤组织分离肿瘤细胞的基因芯片表达数据分别进行差异统计学分析,寻找在霍奇金淋巴瘤发生发展过程中,尤其是同H/RS细胞周围背景T淋巴细胞产生关系密切的细胞因子和趋化因子。分析结果得出部分同肿瘤细胞背景T细胞产生关系密切的细胞因子和趋化因子,如RANTES、CCL22、CCL17、CXCL16、MIG、IL-6、IL-16等,其中RANTES具有重要位置。RANTES(Regulated upon Activation Normal T cell Expressed and Secreted, RANTES又称SISd、Scya5、TCP228和CCL5)通常认为来自激活T细胞的分泌产物,现在已被认为作为一个炎症趋化因子,介导T细胞、单核细胞、NK细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞等的趋化活性。因此它与慢性炎症疾病(如类风湿等)及恶性肿瘤(如恶性黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、胰腺癌,尤其是乳腺癌)密切相关。后有文献也报道经典型HL瘤细胞也分泌RANTES促进背景细胞的趋化。新近文献认为RANTES是经典型HL的重要趋化因子之一,在经典型HL多种细胞株中均能检测有不同程度的RANTES基因和蛋白水平表达。本课题组前期将慢病毒ShRNA质粒转染内源性mCD99L2(mouse CD99antigen like2)基因表达阳性的鼠B淋巴瘤细胞株A20以筛选低表达mCD99L2基因的mCD99L2-A20克隆株时发现其中出现类似人cHL的H/RS样细胞(命名LV-mCD99L2-A20,简称1-1),经鉴定其的确具有H/RS细胞的表型,且RANTES高表达。迄今为止,尚无动物模型能够较好模拟H/RS细胞与周围微环境的状态。由于裸鼠甚至其它重度免疫缺陷鼠缺乏背景免疫细胞,无法募集背景细胞。本组前期通过钴60放射法制备免疫功能抑(?)BALB/c鼠模型,用多种方式接种鼠源性淋巴瘤淋巴瘤细胞株,由于可造成免疫细胞的大量丧失,只限于皮下注射成瘤,并未形成HL样大量反应细胞的背景。而本组前期通过链尿佐菌素(Streptozotocin, STZ)诱导的1型STZ糖尿病鼠静脉注射mCD99L2-A20细胞,有肿瘤形成,同时不乏背景炎症细胞的产生,因此本研究以糖尿病鼠为载体构建荷瘤模型,研究RANTES/CCL5在肿瘤形成中募集背景细胞的作用。为了进一步研究RANTES/CCL5募集炎症细胞对淋巴瘤的生成是否具有促进作用,本研究在前期STZ糖尿病鼠静脉注射A20、mCD99L2-A20细胞株基础上,通过过表达和敲低CCL5这两株细胞,构建STZ糖尿病Balb/c小鼠转移瘤模型,更直接地研究RANTES/CCL5的作用。为此,本研究通过筛选STZ的合适剂量构建糖尿病BALB/c小鼠模型,构建过表达和敲低(?)RANTES/CCL5基因的病毒转染淋巴瘤细胞株,细胞构建成功后进行以糖尿病鼠为载体的体内试验,研究肿瘤形成过程中(?)RANTES/CCL5募集炎症细胞的作用。目的1.以不同剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导1型糖尿病BALB/c小鼠模型构建,成模后各组体内注射鼠源性A20淋巴瘤细胞,通过成模率、临床症状、生存时间以及成瘤率和生存时间来比较分析,筛选出合适的剂量。2.构建低表达和过表达RANTES/CCL5基因的慢病毒载体,分别感染A20细胞和mCD99L2-A20细胞,构建成功后检测细胞株中CD99与p-IKB a表达情况,探究RANTES/CCL5基因与CD99基因和NF-κB信号通路的关系。3.比较A20-vector、mRANTES+A20、mCD99L2-A20-vector、mRANTES+mCD99L2-A20、mRANTES-mCD99L2-A20五株淋巴瘤细胞株在1型糖尿病BALB/c小鼠成瘤情况,观测外周血中RANTES分泌水平、脾脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+FOXP3+Treg细胞比例变化。方法1.BALB/C小鼠1型糖尿病模型的构建Balb/c小鼠200只,随机分为75mg/kg剂量组50只、150mg/kg剂量组50只、200mg/kg剂量组50只、对照组50只。术前禁食12h(自由饮水)称量空腹体质量及监测血糖。实验组腹腔内一次性注射相应剂量STZ,空白对照组腹腔内注射等体积柠檬酸缓冲液。定时取鼠尾静脉血,用血糖仪测血糖浓度。观察各组小鼠成模率及死亡率,流式细胞术测定小鼠脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞比例,观察胰腺组织形态学、成瘤率、死亡率、生存时间。2.过表达和敲低CCL5基因小鼠淋巴瘤细胞株的构建构建以pSin-EF2为载体过表达CCL5基因和pSUPERretro-puro为载体敲低CCL5基因的慢病毒载体,测序成功后,分别转染A20细胞、mCD99L2-A20,经过2周的嘌呤霉素筛选,得到显微镜下高转染效率的绿色荧光细胞,通过RT-PCR、ELISA检测细胞上清液来验证ECCL5基因是否成功导入或敲除。通过RT-PCR、western blotting研究CD99基因、NF-κB信号通路与CCL5基因三者的关系。3.糖尿病鼠淋巴瘤荷瘤模型的构建以及检测其免疫微环境的改变将构建的不同细胞株皮下和静脉注射接种糖尿病小鼠,皮下组每只10只,静脉组分为两个时间段(1个月和3个月),每组10只。观察动物成瘤时间、成瘤率、肿瘤生长速度、死亡率；取肿瘤组织做HE染色观察病理形态改变；荧光共聚焦观察各组小鼠皮下成瘤组织炎症细胞的数目；流式细胞技术检测各组小鼠脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+F0XP3+Treg细胞比例；ELISA检测各组小鼠血清CCL5/RANTES含量。结果1. BALB/C小鼠1型糖尿病模型的构建(1)与对照组相比,造模后STZ150mg/kg组、8TZ200mg/kg组血糖较对照组均显著升高(p<0.05),均一直稳定在高水平(≥11.1mmol/L),STZ75mg/kg组血糖无明显变化(P>0.05). STZ150mg/kg组与STZ200mg/kg组成模小鼠体重均显著减轻(P<0.05),STZ75mg/kg组体重无明显变化(P>0.05)。三实验组成模率分别为0%、90.0%,94.00%,后两组差异无统计学意义(χ2=0.543,P=0.461)。因此,STZ75mg/kg剂量予以排除。后两组死亡率分别为8.0%,37.0%,差异有统计学意义(χ2=7.924,p=0.005)。(2)注射链脲佐菌素4周后取小鼠胰腺组织HE染色,光镜下可见,对照组形态正常,胰岛规则呈类圆形,内分泌细胞排列整齐,大小及分布均匀；STZ150mg/kg组和STZ200mg/kg组小鼠胰腺组织出现异常变化,胰岛正常结构被破坏,胰岛细胞数量大量减少、面积变小；STZ200mg/kgSSTZ150mg/kg组胰岛结构破坏更明显。流式检测正常对照组、STZ150mg/kg组、STZ200mg/kg组脾脏CD4+T细胞比例三组间有统计学差异(F=335.78, P=0.000)). CD8+T细胞比例三组间有统计学差异(F=45.096,P=0.000)。(3)正常对照组、STZ150mg/kg组、STZ200mg/kg组皮下注射A20淋巴瘤细胞,一个月后观察成瘤率无统计学差异(χ2=2.857,p=0.240),STZ150mg/kg组皮下瘤体积与STZ200mg/kg组无统计学差异(t=-1.386,p=0.215)。尾静脉注射A20淋巴瘤细胞,STZ150mg/kg组与STZ200mg/kg组成瘤率无统计学差异(χ2=1.436,p=0.231),死亡率差异明显(χ2=4.167,p=0.041),STZ200mg/kg组死亡率更高,生存时间有明显差异(χ2=4.179,p=0.041),STZ150mg/kg组生存时间更长。2.过表达和敲低CCL5基因细胞株的构建(1)嘌呤霉素筛选2周后,在倒置荧光显微镜下均可观察到有绿色荧光,感染效率都在90%以上。(2)RT-PCR检测：mRANTES+A20、mCD99L2-A20-vector、mRANTES+mCD99L2-A20、mRANTES-mCD99L2-A20细胞的RNATES mRNA表达水平分别是A20-vector细胞的28.864±1.004、4.878±0.226、66.242±0.899、1.416±0.320倍,mRANTES+A20细胞RANTES mRNA的表达高于A20-vector细胞、mRANTES+mCD99L2-A20细胞RANTES mRNA的表达高于mCD99L2-A20-vector细胞,两者比较均有统计学差异(P=0.000),说明CCL5基因成功导入A20和mCD99L2-A20中,mRANTES-mCD99L2-A20细胞RANTES mRNA的表达低于mCD99L2-A20-vector细胞,两者比较有统计学差异(P=0.000)。(3)ELISA检测构建细胞株上清液RANTES含量：mRANTES+A20细胞中RANTES的分泌量(1939.430±66.337pg/ml)高于A20-vector细胞(1215.549±107.637pg/ml),mRANTES+mCD99L2-A20细胞中RANTES的分泌量(1987.066±46.060pg/ml)高于mCD99L2-A20-vector细胞(1494.562±66.306pg/ml),两者均具有统计学差异(P=0.000),mRANTES-mCD99L2-A20细胞中RANTES的分泌量(846.612±53.103pg/ml)低于mCD99L2-A20-vector细胞,两者具有统计学差异(P=0.000)。(4)CD99基因、NF-κB信号通路、CCL5基因三者的关系：通过RT-PCR、western blotting检测,在A20细胞中上调CCL5基因,CD99的表达在mRNA水平和蛋白水平均未发生明显改变,NF-κB信号通路通路中关键因子piκBa蛋白的表达亦为发生明显改变；同时在mCD99L2-A20细胞中上调和下调CCL5基因,CD99与piκBa的表达均未发生明显改变。3.糖尿病鼠淋巴瘤荷瘤模型的构建以及检测其免疫微环境的改变(1)糖尿病小鼠皮下接种mCD99L2-A20-vector、mRANTES+mCD99L2-A20、 mRANTES-mCD99L2-A20细胞,1个月后观察,成瘤率分别为40%(4/10)、40%(4/10)、50%(5/10),差异无统计学意义(P=0.873)；成瘤时间分别为8.25±3.948、11.0±9.416、5.0±1.581天,无统计学差异(P=0.327)；皮下注射mRANTES-mCD99L2-A20细胞组成瘤速度快于mCD99L2-A20-vector、mRANTES+mCD99L2-A20细胞组,但经重复测量数据方差分析,三组成瘤速度无统计学意义(P=0.058)；在600倍高倍镜视野中可观察至mRANTES+mCD99L2-A20细胞BALB/c小鼠成瘤组织可见CD4阳性表达(39.500±4.203个),数目较mRANTES-mCD99L2-A20组(14.500±2.082个)、mRANTES+mCD99L2-A20细胞组(4.200±1.789个)BALB/c小鼠成瘤组织多,三者具有统计学差异(P=0.000)；三组外周血RANTES含量分别为1496.600±340.607pg/ml、1496.600±340.607pg/ml、1378.908±203.607pg/ml,差异不具有统计学意义(P=0.823)(2)糖尿病小鼠尾静脉注射A20-vector、mRANTES+A20、 mCD99L2-A20-vector、mRANTES+mCD99L2-A20、mRANTES-mCD99L2-A20细胞,一个月时大体解剖均无肿瘤形成；三个月时观察,A20-vector、 mCD99L2-A20-vector组均未有肿瘤形成,mRANTES+A20组1只(1/10),mRANTES+mCD99L2-A20组3只(3/10), mRANTES-mCD99L2-A20组4只(4/10)可见肿瘤形成,三组之间的成瘤率无统计学差异(p=0.076); mRANTES+mCD99L2-A20组较mRANTES-mCD99L2-A20组成瘤器官数目少,后者常见肝脏成瘤,其次脾脏、肾脏、胰腺、大肠处有肿瘤块形成,两者无统计学差异(P=0.301);mRANTES-mCD99L2-A20组较mRANTES+mCD99L2-A20组全身淋巴结数目多,,差异具有显著性(P=0.034)。(3)三个月时取脾脏组织流式检测CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+FOXP3+Treg细胞比例,正常组与糖尿病鼠相比,后者两种T细胞均减少(均p=0.000),Treg细胞增加(p=0.026)。①未成瘤小鼠脾脏CD4+T细胞比例,mRANTES+A20细胞组CD4+T细胞比例(16.889±0.884%)少于A20-vector细胞组(24.890±1.294%),差异具有统计学意义(P=0.000);mRANTES-mCD99L2-A20细胞组CD4+T细胞比例(25.567+1.222%),mRANTES+mCD99L2-A20细胞组比例(14.342±0.898%),均高于mCD99L2-A20-vector组(6.800±1.097%),差异具有统计学意义(P=0.000),且mRANTES-mCD99L2-A20组比例较mRANTES+mCD99L2-A20高,差异具有统计学意义(P=0.000)；②未成瘤小鼠CD8+T细胞比例,mRANTES+A20细胞组CD8+T细胞比例(6.278±0.412%),低于A20-vector细胞组(8.670±0.523%),差异具有统计学意义(P=0.000)；与mCD99L2-A20-vector组(3.890±1.446%)相比,mRANTES-mCD99L2-A20细胞组CD8+T细胞比例(8.333±0.715%)较高,差异具有统计学意义(P=0.000),mRANTES+mCD99L2-A20细胞组(4.700±1.160%)无明显差异(P=0.090)；③各组未成瘤小鼠CD4+FOXP3+Treg细胞比例,mRANTES+A20细胞组CD4+FOXP3+Treg细胞比例(3.878±0.768%)高于A20-vector细胞组(1.490±0.304%),差异具有统计学意义(P=0.000)；与mCD99L2-A20-vector组(0.920±0.210%)相比,mRANTES-mCD99L2-A20细胞组CD4+FOXP3+Treg细胞比例(2.767±0.493%)较高,差异具有统计学意义(P=0.002), mRANTES+mCD99L2-A20细胞组(1.043±0.294%)无明显差异(P=0.998)。(4)三个月时检测各组小鼠外周血上清RANTES蛋白的分泌,正常组与糖尿病鼠相比,后者分泌量增多(P=0.036)。尾静脉注射不同肿瘤细胞组,RANTES蛋白分泌量无统计学差异(均P>0.05)。结论1.链脲佐菌素(STZ)诱导构建糖尿病鼠,150mg/kg剂量成模率高,死亡率低,成瘤后生存时间长,为理想剂量。2.过表达和敲低CCL5基因的慢病毒颗粒成功转染A20和mCD99L2-A20细胞,且CCL5基因的表达受CD99基因与NF-κB通路调控。3.糖尿病鼠淋巴瘤荷瘤模型中,过表达CCL5/RANTES能促进局部炎症因子募集,对全身免疫微环境改变不明显。