蜂毒肽(melittin)是欧洲蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒中的主要成分之一，约占蜜蜂毒液干重的40％～50％。蜂毒肽具有26个氨基酸残基，是一条直链肽，分子量约为2840Da，其氨基酸序列为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ。蜂毒肽是强碱性无细胞选择性的细胞溶解肽，具有多种生物学活性。由于蜂毒肽具有很强的溶血作用，极大地限制了其在医药领域的应用。因此，如何降低或消除其溶血活性，保留甚至增强其抗菌、抗肿瘤等功能，已成为医药学家研究的热点。本研究的预期目的是通过改换蜂毒肽分子一级结构中的个别关键性氨基酸组份，在保留其抗菌功能的前提下，降低溶血活性，同时研究其溶血作用的生化机理。主要研究结果如下： 1、蜂毒肽分子结构设计 蜂毒肽分子结构中两个α-螺旋上任意残基缺失，都将导致其溶血活性降低，而对抑菌活性无太大影响。位于第二螺旋上的第13位亮氨酸是α-螺旋的强形成者，根据蜂毒肽分子结构的特点，将其序列分别做如下氨基酸的改换：①第13位的亮氨酸改换为苏氨酸；②将第13位的亮氨酸删除。经蛋白质结构分析，改换氨基酸之后的蜂毒肽分子α-螺旋度均有所降低。其螺旋度的最低值分别为0.901和0.900，均低于原始序列最低值0.943。通过降低分子结构的螺旋度以期达到降低溶血活性，保留抗菌功能的目的。 检索Genbank得到蜂毒肽氨基酸序列，推导出其基因的全长序列。考虑到毕赤酵母利用各遗传密码子的频率不同，借助DNAsis分析软件，对其中部分密码子进行调整，设计出新的蜂毒肽基因全长序列： ZM1R13： GGTATCGGTGCTGTTTTGAAGGTTTTGACTACTGGTACTCCAGCTTTGATCT CCTGGATTAAGAGAAAGAGACAACAA ZM2D13： GGTATCGGTGCTGTTTTGAAGGTTTTGACTACTGGTCCAGCTTTGATCTCCT GGATTAAGAGAAAGAGACAACAA 2、蜂毒肽基因在毕赤酵母中的表达 构建pPICZα-A-ZM1/ZM2重组载体，通过电击法转化Pichia pastoris宿主菌，经PCR确认阳性克隆后，用MMH/MDH法筛选Mut<+>型菌株，诱导发酵，琼脂扩散法鉴定生物活性，Tricine-SDS-PAGE小分子量蛋白电泳分析，证实蜂毒肽基因已整合到P.pastoris基因组。表达产物经α-factor信号肽引导分泌到培养基中。测定表达的蜂毒肽ZM1和ZM2的表达量分别为90.24 μg/mL、128.97μg/mL。 3、基因表达的蜂毒溶血肽功能分析 通过检测在红细胞悬浮液中加入不同体积表达产物zMl和ZM2体系的吸光值来比较其溶血活性，各对应体系的ZM1OD<,542>nm均大于ZM2OD<,542>nm，判断ZM1的溶血活性强于ZM2；利用试管稀释法测定表达产物的MIC，计算出表达产物ZM1、ZM2，的最小抑菌浓度分别为0.241μg/mL、0.172μg/mL。经过氨基酸改换后的蜂毒肽序列ZM1和ZM2的α-螺旋度均有所降低，且ZM2的螺旋度低于ZM1，获得表达产物ZM2不仅溶血活性低于ZM1，且在抑菌活性及表达量方面均优于ZM1。 4、蜂毒肽溶血机理的研究 本研究通过设计红细胞孵育渗透脆性试验、G-6-PD荧光斑点试验、Na<+>-K<+>-ATP酶活性测定试验、阴离子交换蛋白荧光强度测定试验、单细胞凝胶电泳试验，结果表明：蜂毒肽具有很强的溶血作用，能严重影响红细胞G-6-PD活性，造成酶活性丧失，Na<+>K<+>-ATP酶活性降低，阴离子交换蛋白转运Cl<->/HCO<,3><->活性增强，而对鸡红细胞的细胞核无影响，对DNA没有破坏作用。