研究背景电磁、声、光等多种物理因子在人们的生活和工作环境中无处不在,这些物理因子对于机体的生物学效应尤其是对神经系统的影响值得深究。大量相关研究表明,海马与学习记忆及空间导航等重要脑功能密切相关。同时,海马通过内嗅皮层与多个感觉皮层相互联系,这一解剖学特点使得海马在功能上成为一个多元信息的整合中枢,因此海马能够处理各种感觉信息。作为各种物理刺激的重要靶标之一,海马神经元在声、光、电磁等外界常见干预因素的作用后,会发生怎样的功能上的变化是值得关注的,然而目前直接在在体情况下揭示物理因子刺激与脑神经元活动变化之间的关系的研究是极少的。膜片钳实验技术是脑科学研究中一项重要的电生理技术,能够记录单个神经元的放电活动,反映出细胞膜上离子通道的状态、膜电位的变化等与细胞功能状态密切相关的生理活动,帮助我们在细胞水平阐明特定脑功能的神经活动机制。本课题中,为了研究激光闪光刺激对脑组织功能状态的影响,我们使用实验室内经典的激光刺激方法,施加不同波长的激光刺激并观察海马神经元的实时反应,进而为物理刺激影响脑功能提供直接实验证据。为了观察闪光刺激对活体动物神经功能的实时效应,我们采用在体膜片钳技术来记录大鼠在受到外界刺激的同时脑组织内单个神经元电活动的实时变化过程。研究目的探索激光闪光刺激对大鼠海马神经元电活动的影响规律,为应用物理刺激影响脑功能的研究提供直接实验证据。第一部分海马神经元活动的在体膜片钳记录内容和方法1.内容:建立记录大鼠海马神经元电活动的在体膜片钳技术2.方法:实验方法主要分为动物手术和电生理记录两部分,具体如下:2.1不断练习动物手术,熟悉实验步骤并掌握实验技巧,通过精细的手术操作暴露出较洁净的脑面,并通过气管插管和体温维持来保证动物的良好生理状况。2.2电生理记录关键在于封接和破膜,在这些实验过程不断尝试和优化各个关键环节的操作步骤。研究结果1.通过改善动物整体状态、清洁脑面暴露环境、调整全细胞膜片钳封接和破膜参数、成功记录到海马神经元的诱发放电和自发放电,放电的膜电位均值为-62.25±2.13 m V,动作电位幅值为63±4.23 m V,半宽时程为1.26±0.38 ms。2.80%的海马神经元出现自发放电,平均发放频率为自发4.82±1.79 Hz。而自发放电总体分为单个动作电位连续发放与爆发式放电两种模式。第二部分不同单色光闪光刺激对大鼠海马神经元活动的影响内容与方法1.内容:研究不同单色光闪光刺激对大鼠海马CA1区锥体神经元电活动的影响规律。2.方法:采用在体膜片钳技术记录大鼠海马神经元的放电活动,并对接受闪光刺激后的视网膜进行组织学检查。方法如下:2.1健康成年SD大鼠麻醉后,行气管插管术,开颅钻孔暴露脑面,进行在体膜片钳记录。全细胞记录稳定后,采用4种不同波长的单色激光经大鼠眼球进行闪光刺激,记录大鼠海马神经元的反应。采用不同功率的紫色激光对大鼠经眼球进行闪光刺激,记录其海马神经元活动的变化规律。2.2对闪光刺激后的眼球和未经光照的眼球进行视网膜冰冻切片和HE染色,观察接受闪光刺激后的视网膜结构是否有损伤。研究结果1.对大鼠眼球进行短暂(100 ms)的激光照射时,发现红、绿光不会引起海马神经元的膜电位变动,而蓝紫光会引起海马神经元膜电位向超极化方向变动。2.蓝光引起的超极化变化,其幅值与持续时间分别为9.05±0.71 m V和116.4±11.90 ms,这与紫光引发的相应变化(幅值为9.78±1.67 m V,反应持续时间为99.23±13.31 ms)之间不存在显著的差别。3.紫光引起的超极化变化与功率成正相关,并且激光功率在125 m W范围以内时,对大鼠视网膜组织的各层结构均没有造成损伤。第三部分膜片钳记录海马神经元的生物素(Biocytin)标记和神经元类型初步鉴定内容与方法1.内容:对膜片钳记录的海马神经元进行biocytin标记和神经元类型初步鉴定2.方法:利用biocytin标记法观察效应神经元的形态,采用VGlu T1免疫荧光染色鉴定效应神经元的类型。方法如下:2.1在电生理记录的同时对被记录的神经元进行生物素标记,在电生理记录完成后,取出大鼠的脑组织进行不同厚度的冰冻切片,并采用贴片/漂片的染色方法,使被biocytin标记的神经元显色。2.2对biocytin标记的神经元进行VGlu T1免疫荧光染色。研究结果1.通过比较贴片染色法与漂片染色法对不同厚度冰冻切片的形态学染色结果,发现对片厚60μm的脑片进行漂片染色,可以对在体biocytin标记的海马神经元的形态有很好的显示,从其树突及胞体的形态结构可判断其为典型的CA1区锥体神经元。2.Biocytin标记的有超极化反应的神经元在与其他细胞标志物共染后发现,该类神经元为VGlu T1免疫反应阳性神经元。研究结论1.建立了大鼠海马神经元的全细胞膜片钳实验方法,并成功记录到海马神经元的自发放电和诱发电位。2.观察不同单色光激光照射对大鼠海马锥体神经元的影响,发现在动物麻醉状态下,给予蓝色和紫色激光闪光刺激能够引起海马锥体神经元出现明显的膜电位的超极化反应,并且超极化的幅值与紫光功率成正比,而红光和绿光没有明显的效应,表明特定波长(紫色和蓝色)激光短暂照射能够引起海马神经元的抑制性变化。3.采用biocytin标记方法和免疫荧光染色,初步证明上述膜片钳记录到的海马CA1区神经元多数为VGlu T1免疫反应阳性的锥体神经元。4.由于在体膜片钳技术的成功率较低,目前我们仅对不同功率强度的闪光刺激引发的神经元超极化反应的量效关系进行了初步论证,未来尚需积累更多的数据来进一步明确不同参数闪光刺激引起海马神经元的超极化效应的量效关系,并对反应神经元的神经化学特性、纤维联系和功能意义方面进行深入探讨。