第一部分肝脏部分切除术后肝脏损伤修复不同病理阶段的界定研究背景：肝脏具备强大的再生能力,能在遭受炎症或外科手段打击下,通过肝细胞的代偿性肥大或增殖来修复正常的体积和功能。大部分肝脏切除术所构建的肝脏再生往往伴随着不同程度的炎症损伤,使我们在机制研究中难以判别所研究参数是起有害或有利于再生的作用,因此明确区分界定肝脏再生过程的不同生理阶段,将为后续的研究奠定扎实的基础。方法：本研究采用70%大部分肝脏切除手术(partial hepatectomy, PH)构建肝脏再生模型。126只雄性SD大鼠随机分为三个大组：正常对照组 (n=6),假手术组(n=60)和肝脏切除组(n=60)。其中假手术组和肝脏切除组分别根据大鼠处死时间分成十个亚组：12、18、24、30、36、48、72小时、7天、10天和14天。采集下腔静脉血用于生化指标检测,肝组织用作病理学、免疫组化和细胞因子mRNA(肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子-β(TGF-β))检测。结果：血液中肝脏生化功能指标(ALT、AST和胆红素)在术后24小时内达到高峰,术后72小时恢复正常水平；同样,肝脏病理学镜检结果和炎症评分也显示肝脏炎症损伤在术后24小时最严重。5-BrdU和Ki-67阳性的肝细胞比例反映了进入细胞周期S期和活跃期的细胞比重,免疫组化染色结果显示肝细胞再生活动在术后30小时明显增加,至48小时进入S期的肝细胞比例最高。肝内各细胞因子mRNA表达在术后迅速上调,并分别于24小时(TNF-α和IL-6、),18小时(HGF)和72小时(TGF-β)达到最高水平。结论：根据PH术后炎症和再生指标的不同表现,本实验中我们可以把肝脏再生分成以下三个阶段：启动期(12-24小时)、增殖期(30-48小时)和终止期(3-14天)。第二部分肝脏再生过程肠道菌群结构变迁研究背景：肠道菌群及其代谢物质通过肝-肠轴与肝脏在解剖及功能上密切相关,已经肠道细菌在肝脏再生过程中扮演重要角色,然而肠道微生物群落中影响肝脏再生的关键功能菌迄今为止没有深入研究过。方法：本研究采用MiSeq 2000测序技术结合多变量统计学方法,对来自肝脏切除大鼠的粪便样品肠道细菌多样性及其组成进行了详尽的分析,并且在PICRUSt工具(通过隐性状态重建群落系统进化的研究)的帮助下,发掘肠道细菌功能基因的变化。结果：研究发现PH大鼠肠道细菌多样性与正常组无明显差异。对肠道细菌多样性组成的整体结构特征进行主坐标分析和非线性多维度分析,显示不仅是PH组与正常组存在明显的肠道细菌结构差异,不同时间点的PHx组间也发生了菌群构成的变迁。在门的水平上,与正常对照组相比,PHx粪便内容物中厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门丰度均发生了明显改变。在再生早期(12-24小时),厚壁菌门相对含量明显升高,随着肝细胞再生的活跃,其丰度逐渐下降,48小时降至最低水平,令人意外的是,厚壁菌门在术后的3-14天并未恢复正常水平,而是维持较高的相对含量。而拟杆菌门则呈现相反的变化趋势。相对应的是,厚壁菌门/拟杆菌门比值也经历了降低-升高-降低的波动过程,提示肠道菌群在肝脏再生过程中不断调整结构,改变能量摄取效率。厚壁菌门的改变归因于Ruminococcaceae和Lachnospiraceae,而拟杆菌门的变化主要由Bacteroidaceae、Prevotellaceae、 Rikenellaceae和Porphyromonadaceae引起。同时我们在细菌相对丰度的基础上,在纲、目、科的水平上对样品进行聚类分析,发现在科的水平上来自12-24小时、30-48小时和3-14天的粪便样品可以被清楚地分为三个簇,与第一部分中肝脏再生三个生理阶段的划分相符。因此在下一步功能基因预测分析中,我们分别选用12小时、48小时和14天作为每一阶段的标志时间点。在术后12小时,肠道菌群功能基因在与代谢相关的途径相对含量较高,如"lipis metabolism"、"carbohydrate metabolism",而48小时细菌的编码基因更多的与基因生物合成加工有关,如"replication and repair",同时在与肠道细菌代谢物质相关的功能类群的相对含量也较高。结论：本研究描绘了肝脏再生过程中肠道微生物群落的整体结构的变化,鉴定出与肝再生相关的关键功能菌,并初步解读这些细菌的潜在功能,为理解肠道细菌和肝脏再生的重要关系提供了基础数据。第三部分肝脏再生过程中肠道菌群与代谢物质共变化研究研究背景：肝脏部分切除所触发的肝细胞增殖活动使机体对能量的需求增加,正如本研究第二部分中观察到的,肠道菌群作为功能性“代谢器官”,其功能基因组调节的代谢途径在PH术后发生了改变,这些变化是否参与了肝脏再生宿主代谢过程仍是个谜题,也正是本研究第三部分的探讨重点。方法：通过超高效液相色谱-质谱(UPLC/MS)技术鉴定肝脏再生宿主代谢谱特征,筛选肝再生相关的生物标志物,并结合代谢途径分析法(MetPA)确定差异性代谢通路,最终建立肝脏再生过程中肠道菌群与代谢途径的关联。结果：应用主成分分析及正交偏最小二乘-判别分析法对UPLS/MS数据分析显示,肝脏再生早期(12-24小时)、中期(30-36小时)及晚期(3-14天)血液样品的代谢谱在空间上均能得到很好的区隔。根据VIP和非参数t-test结果,我们鉴定了在正常组与PH间有显著差异的84个标志物,主要包括七大类物质：胆汁酸、胆素原、甘油磷脂、氨基酸、脂肪酸、酰基肉毒碱和维生素。在这84个代谢物中,我们发现有15个物质在肝脏再生的三个不同阶段也存在表达差异,分别为脑磷脂(PE)(20：4/14：0)、卵磷脂(PC) (22:5/15:0)、PC(20:3/15:0)、溶血卵磷脂(Lysopc)(18:4)、L-辛酰基肉碱、胆红素、L-尿胆原、泛素、D-白氨酸、D-葡萄糖胺、2,3-二氨基丙酸、1-甲基组胺、核糖醇、庚二酸、3-硫代脱氧胆酸鹅和亚牛磺酸。经MetPA软件分析,上述16种差异物质积聚的代谢通路有花生四烯酸代谢、亚麻酸代谢、甘油磷脂代谢、GPI锚蛋白生物合成、组氨酸代谢、牛磺酸及亚牛磺酸代谢、泛酸及辅酶A代谢、卟啉及叶绿素代谢。其中甘油磷脂和牛磺酸及亚牛磺酸代谢被鉴定为对代谢差异贡献最大的两条通路。最后结合spearman’rank correlation分析,将肠道菌群相对丰度数据与血液生物标志物相对强度加以联系,寻找肠道细菌结构与宿主整体代谢的共变化特征,并且鉴定出8种与肝再生代谢密切的重要肠道细菌成员,分别是毛螺菌科、普雷沃氏菌科、瘤胃菌科、拟杆菌科、理研菌科、紫单胞菌科、梭菌科和柔膜菌科。其中一些细菌与多种血液代谢浓度变化相关,如Butyricimonas、Erysipelotrichaceae incertae sedis和Paraprevotella,提示了这些细菌可能影响着肝再生过程中多个代谢通路。结论：本研究中在描绘肝脏再生相关宿主代谢特征的同时,建立了肠道菌群与特征代谢物间的联系,提示肠道菌群参与调节肝脏再生过程中的代谢平衡,为维持正常肝脏再生功能提供了新的研究视野。