海地瓜(Acaudina molpadioides)和黑乳参(Holothuria nobilis)分别归属于海参纲芋参目尻参科和海参纲摘手目海参科,这两种海参在我国资源分布广泛。由于其市场价格及食用价值远低于刺参(StichopuS japonicus),故未得到全面的开发利用。海参多糖是海参体壁主要的活性成分,通常分为岩藻糖基化硫酸软骨素(Fucosylated ChondroitinSulfate,FucCS)和岩藻聚糖硫酸脂(Fucan)两种类型。其中FucCS是海参体壁中非常重要的一种酸性黏多糖,不同海参的FucCS结构和活性都有所不同。本实验室已对这两种低值海参FucCS的一级结构及其体外抗凝血和抗肿瘤活性进行了研究。为进一步完善这两种低值海参多糖的结构和生物学活性研究,本文分别对采自江苏省连云港的海地瓜和黑乳参的FucCS高级结构和抗氧化活性进行了探索。对比这两种海参的FucCS的结构和生物学活性,选择降解黑乳参FucCS多糖,优化其降解条件,并分析其寡糖的一级结构。主要结果如下:1 FucCS的高级结构通过旋光度分析,圆二色谱分析,原子力显微镜分析,粘度法及扫描电镜分析对两种FucCS多糖ACP(来自于海地瓜)和HOP(来自于黑乳参)溶液行为及表面形态进行了初步研究。结果表明,多糖ACP和HOP水溶液旋光度分别为-46°和-22°,其特性粘度值分别是145.52 ml/g和7.30 ml/g。通过圆二色谱分析发现,ACP和HOP分子构象受温度和pH值的影响,其中pH值的改变对分子链构象影响更大,特别是碱性条件下会导致构象突变。且ACP和HOP分子中不可能存在高度有序的双螺旋或三螺旋构象。通过原子力显微镜和扫描电镜观测发现,ACP表面粗糙,由大小不一的多糖分子聚集而成,聚集体直径大约为60 nm;而HOP表面光滑,多糖分子聚集程度低,分子高度为2nm左右。2 FucCS的体外抗氧化活性通过测定多糖ACP和HOP对DPPH,羟基自由基和超氧自由基的抑制效果,探讨ACP和HOP体外抗氧化活性。结果表明,ACP和HOP具有较好的抗氧化活性,但抗氧化活性低于人工合成的抗氧化剂VC。多糖ACP和HOP的剂量—效应线性关系不显著,当ACP和HOP为低浓度时,对自由基抑制率随浓度的增加而增加,当浓度增加到一定值后,两者对自由基的抑制率增加缓慢。当样品浓度达到0.5 mg/m1时,ACP和HOP对自由基的抑制率达到最高。3 HOP寡糖制备及结构解析双氧水法降解多糖HOP,并通过部分因子设计(FFD),中心复合设计(CCD)和响应面设计(RSM)优化多糖HOP整个氧化降解过程,对影响降解的主要因素金属离子、H2O2-HOP的比例R,H202流速,反应的pH,反应时间,反应温度和HOP的浓度的最佳水平范围及其交互作用进行了研究和探讨。结果表明,最佳氧化降解条件是:金属离子为 Fe2+,R(H2o2-HOP)值为 0.53,H2O2 流速为 0.40mL/min,pH 为 6.91,反应时间为2 h,温度为30 °C,HOP浓度为4 mg/mL。根据最佳降解条件降解多糖,最终得到分子量为7.9 kDa的寡糖(D-HOP)。通过三氟乙酸(TFA)水解法和PMP柱前衍生化-HPLC结合法,确定寡糖的单糖组成;通过BaC12-明胶比浊法确定了寡糖硫酸基团的含量;通过(-)-2-丁醇的GC分析确定了寡糖中单糖的绝对构型。结果表明,寡糖中三种主要单糖分别为葡萄糖醛酸(GlcUA),半乳糖胺(GalNAc),岩藻糖(Fuc),且GlcUA和GalNAc的摩尔比约为1:0.80,与HOP中单糖组成及GlcUA和GalNAc摩尔比结果一致,骨架结构为→→4GlcAβ1→→3GalNAcβ1 →,其单糖绝对构型为 D-GlcUA,D-GalNAc 和 L-Fuc。以 1摩尔的Fuc作参照,寡糖硫酸基团的含量为3.27。此外,通过高效体积排阻凝胶渗透色谱法(HPGPC-SEC)确定寡糖的分子量为7.9kDa。寡糖的NMR谱图提供了更多寡糖一级结构的信息。在寡糖1 H NMR谱图中,5.0-5.7 ppm的化学位移是异头质子信号区,说明了αα型硫酸岩藻糖残基的存在,并得出中寡糖的硫酸基团取代类型为Fuc2,4S,Fuc3S,Fuc4S和FucOS,其中Fuc4S在HOP的1HNMR图谱中未出现。寡糖13CNMR谱进一步提供碳骨架信息,验证了寡糖是由L-Fuc,D-GalNAc和D-GlcUA组成,与HOP的碳骨架相同。