目的：恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一。目前治疗肿瘤的方法主要有手术、放射、药物和免疫疗法。化学药物治疗是肿瘤治疗中发展最快的一个领域，在肿瘤的治疗中发挥着越来越重要的作用。抗癌药物的发现离不开抗癌药物的筛选，从天然产物中提取抗癌活性成分，或通过结构改造合成新的先导化合物，从中筛选出新的抗癌药物的新药发展途径依然非常重要。咕吨酮又叫二苯并γ吡喃酮，其母体本身并不存在于植物中，但其衍生物广泛分布在自然界中，是药用植物的有效成分之一。自然界中得到的咕吨酮衍生物主要是从龙胆科、桑科、藤黄科、远志科和金丝桃属等科属植物以及一些真菌的代谢产物中分离得到。由于大多数的呫吨酮衍生物在其线性排列的三个环上有酚性官能团，所以它们经常表现出广泛的生物和药理活性。我国民间所用于治疗肝炎、类风湿、挫伤、神经痛、肺结核、哮喘等疾病的药物，常富含呫吨酮类衍生物成分。　　 第一部分咕吨酮类化合物体外抗增殖活性实验。　　 ⑴体外抗肿瘤增殖活性筛选。　　 方法：体外噻唑蓝(MTT)法，分别取对数生长期的HepG2细胞、Lovo细胞、KB-3-1细胞、CNE-2细胞、HeLa细胞、Capan2细胞、K562细胞、U937细胞，每种化合物均设不同剂量的用药组及相应的溶剂对照组培养72h，实验终止前4h加入MTT溶液，待完全显色后用酶联免疫检测仪测每孔OD值。按公式求出增殖抑制率和半数抑制浓度(IC50值)。所有实验均重复3～6次。　　 结果：总体上此系列化合物对不同的肿瘤细胞株敏感性有差异，其中多数的化合物对肝癌细胞HepG2的敏感性较其他的实体瘤要高。在咕吨酮的母核上引入羟基、乙酰基、烷基等基团后，抗肿瘤活性多出现不同程度增加。尤其是羟基的引入，C-3位点环氧环、邻双醇和哌啶基团的引入和苯咕吨酮的结构改造能使体外抗肿瘤作用有明显的提升。　　 ⑵对肝癌细胞HepG2与正常肝细胞L02的抑制活性和肿瘤的选择性。　　 方法：培养L02肝细胞。使用上述MTT法对比分析活性最好的6个化合物对肝癌细胞HepG2和正常肝细胞L02的体外抗增殖作用差异，用IC50L02/IC50HepG2求出肿瘤选择系数。　　 结果：筛选出的6个抗肝癌细胞HepG2活性最好的化合物对HepG2和L02的肿瘤选择系数为6.8～12.5，远高于阿霉素的肿瘤选择系数1.6，表现出对肿瘤细胞作用的良好选择性。见表1.2　　 第二部分 LY11诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及相关机理研究。　　 ⑴激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡形态。　　 方法：取对数生长期的HepG2细胞接种于激光共聚焦显微镜专用细胞培养皿，设高中低剂量组，48h终止作用，处理细胞，DAPI染色后，在激光共聚焦显微镜下观察。　　 结果：未处理的HepG2细胞核呈弥散均匀较弱荧光。LY11作用后呈现典型的凋亡细胞型态：细胞变小，染色质浓缩，荧光强度增强，有些细胞染色质聚集于核膜下，呈新月状，有些分叶块状，部分凋亡小体形成，　　 ⑵流式细胞仪检测细胞周期改变。　　 方法：收集不同浓度、不同时间的LY11处理后的HepG2细胞，PBS洗涤2次，70％乙醇固定过夜。离心弃乙醇，再次悬浮于PBS，细胞经溴化丙啶(PI，10μg/ml)染色，在流式细胞仪上检测细胞DNA含量，得出每份样品的G1,、S和G2/M期细胞分布图以及亚G1期(凋亡)细胞所占比例。LYSIS软件(BectonDickinson公司产品)分析。　　 结果：流式细胞仪分析显示，经过8μM的LY11处理HepG2细胞12h，24h，36h后，和经过2μM、4μM、8μM的LY11处理48h后，与未处理组的HepG2细胞比较，经过统计分析，处理组和未处理组之间的G1、S、G2/M期各期细胞所占比例未见明显变化，可见LY11对HepG2细胞无周期特异性作用。　　 ⑶Annexin V/PI染色观察细胞凋亡。　　 方法：将处理后的HepG2细胞用不含EDTA的胰酶消化收集;用PBS洗涤，收集细胞；用Binding Buffer悬浮细胞；加入5μLAnnexin V-FITC混匀后，再加入5μL Propidium Iodide，混匀;室温避光反应，进行流式细胞仪的观察和检测。　　 结果：结果显示经过8μM的LY11分别处理12h、24h、36h后，HepG2细胞的凋亡率分别为17.0％、26.8％、30.7％，经过2μM、4μM、8μM的LY11处理48h后HepG2细胞的凋亡率分别为11.3％、30.6％、35.2％。结果可见HepG2细胞的凋亡率随着LY11作用时间的延长或者作用浓度的提高而增加。　　 ⑷LY11对TopoⅡ酶活性的抑制作用。　　 方法：配置反应Buffer：50mM Tris-HCl(pH7.5)，120mM KC1，10mM MgCl2，0.5mM dithiothreitol，1mM ATP，在反应Buffer中加入0.2μg的pBR322，加入4U的TopoⅡ，加入不同浓度的LY11，充分混合，置于37℃作用30分钟，35V，4小时电泳，凝胶以EB染色10分钟；观察结果。　　 结果：本研究使用pBR322为底物检测了LY11对TopoⅡ酶活性的抑制作用。实验发现16μM，4μM和1μM的LY11均能产生对TopoⅡ酶的抑制作用，与浓度呈量效关系。　　 ⑸LY11对HepG2细胞Topo H蛋白表达的影响。　　 方法：同第2章　　 结果：Western Blot分析显示，经过2μM、4μM、8μM的LY11处理48h后，HepG2细胞的TopoⅡ蛋白表达出现明显改变。随着浓度的升高，TopoⅡ蛋白表达出现明显的下调趋势。经过4μM的LY11处理24h、36h、48h后，HepG2细胞的TopoⅡ蛋白表达也出现明显改变，随着作用时间的延长，TopoⅡ蛋白表达出现了明显的下调趋势。　　 ⑹RT-PCR法检测TopoⅡαmRNA表达情况。　　 方法：经过2μM、4μM、8μM的LY11处理HepG2细胞48h后，按照文献报道使用Trizol提取各组细胞的总RNA，按照试剂盒操作说明书，进行RNA逆转录反应。将反应产物进行PCR反应。电泳，观察结果。　　 结果：RT-PCR结果显示，随着LY11处理浓度的增高，TopoⅡα的mRNA的表达下降，当LY11的处理浓度增加至8μM时，HepG2细胞的TopoⅡ的mRNA基因表达明显下降。　　 ⑺彗星实验观察DNA损伤。　　 方法：将LY11处理后的细胞洗涤离心收集，磨砂玻片浸入正常熔点琼脂糖中，制成第一层胶。取细胞悬液加入低熔点琼脂糖混匀，滴在第一层胶上，制成第二层胶。裂解后25V稳压电泳20min，中和后PI染色，荧光显微镜下观察拍照，统计拖尾率，测尾长。　　 结果：收集经过不同浓度的LY11和20μM的DDP处理24h后的HepG2细胞，经过单细胞凝胶电泳实验后观察可见，随着LY11浓度的增高(0、2、4、8μM)，彗星现象逐渐明显，分析发现处理组和未处理组间的彗星拖尾率和尾距均有明显差异。　　 结论：　　 ①本系列咕吨酮化合物对人肝细胞癌细胞株HepG2有相对较好的抗增殖活性，其中化合物LY11活性最强。活性较强的六个化合物的抗HepG2增殖作用与抗正常肝细胞L02增殖作用相比，显出了良好的肿瘤选择性效应。　　 ②本系列咕吨酮化合物抗肿瘤细胞HepG2活性的构效关系分析显示，在咕吨酮母核上引入羟基，增加苯环或在C-3位上引入环氧乙烷基均可能有助于抗肿瘤活性的提高。　　 ③对化合物LY11的研究表明，LY11能抑制抗凋亡基因Mcl-1的蛋白表达，激活HepG2细胞线粒体通路，引起线粒体膜电位改变，进一步激活了Caspase9和Caspase3，引起细胞凋亡。　　 ④化合物LY11能明显抑制TopoⅡ的活性，同时能明显抑制HepG2细胞中TopoⅡ的mRNA和蛋白水平的表达，表明TopoⅡ是LY11抗肿瘤的作用靶点之一。　　 ⑤化合物LY11能直接引起HepG2的DNA的损伤，造成细胞凋亡。