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Ⅱa类细菌素是乳酸菌细菌素的一个亚类,为抗李斯特氏菌的多肽,对热稳定;可被人体生物降解和消化,对健康无害,是一类控制李斯特氏菌污染最具潜力的抗菌肽,对食品保藏具有重要意义。因此Ⅱa类细菌素的基础研究和应用研究成为近年来的研究热点。到目前为止,所发现的20多种Ⅱa类细菌素大多采用传统的筛菌方法和繁琐的分离纯化得到,存在干扰因素多,产量低,分离纯化困难等问题,故很难再迅速挖掘出新的Ⅱa类细菌素。鉴于这类细菌素序列的保守性,利用基因组学和生物信息学来寻找新的细菌素已成为一种有效的工具;而细菌素的异源表达则克服了产生菌细菌素调控系统的制约,使其可以连续生产或超量表达。所采用的表达系统主要是大肠杆菌系统、乳酸菌系统和酵母菌系统,其中大肠杆菌系统最常用,表达的细菌素主要以胞内融合的包涵体形式存在,其后续的处理过程较为复杂繁琐。近年来,一种无细胞蛋白质合成系统发展迅速,成功地架起了基因与蛋白质之间的桥梁,能使外源基因在体外快速表达,并且避免了细胞体系中宿主菌的复杂调控和新陈代谢带来的干扰,以及基因工程菌表达抗菌肽时对宿主的毒性作用。因此,无细胞蛋白质合成系统将成为Ⅱa类细菌素重组表达的一种有效手段。本文以通过基因组学和生物信息学工具挖掘到的一条潜在的Ⅱa类细菌素基因NB-C1为研究对象,进行不同策略的重组表达研究,从而实现NB-C1基因的高效活性表达,并对其抑菌活性进行鉴定。首先构建了NB-C1基因的表达载体pIVEX2.4d-NB-C1以及带绿色荧光蛋白(GFP )和硫氧还蛋白( TrxA)标签的融合表达载体pIVEX2.4d-GFP-NB-C1和pIVEX2.4d-TrxA-NB-C1。将各表达载体分别在大肠杆菌系统(BL21(DE3)和BL21(DE3)plysS)和大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统中进行表达,其中pIVEX2.4d-GFP-NB-C1在体内和体外系统均成功表达出可溶性的融合蛋白,可溶性蛋白的表达量分别为体内表达量840μg/mL,体外表达量730μg/mL(间歇式反应,Batch-mode)和2.2 mg/mL(连续交换式反应,CECF-mode);pIVEX2.4d-TrxA-NB-C1在体内表达的融合蛋白以胞内包涵体形式存在,在无细胞系统中则能实现可溶性表达,但表达量较低。将体内和体外表达的GFP-NB-C1进行Ni-NTA亲和层析柱纯化后,分别得到纯度95%和98%的融合目的蛋白36 mg/L和0.26 mg/mL。以单核增生李斯特氏菌为指示菌,检测各表达产物的抑菌活性,结果表明可溶性表达的NB-C1融合蛋白均表现出对李斯特氏菌的抑制作用。本研究建立了一条从Ⅱa类细菌素基因到其重组表达获得活性蛋白质的通路,并探讨了各种表达策略及其表达水平,这为新型Ⅱa类细菌素基因的挖掘及其重组表达研究提供了借鉴。