我国常见棘豆属植物的遗传进化及与内生真菌和苦马豆素含量的关系

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棘豆属植物在我国西部草原及荒漠区分布广泛,是草原植被的重要组成部分。其中部分种因含有生物碱——苦马豆素(SW)而带有毒性,牲畜采食或误食后会发生中毒,因此被称为棘豆毒草。有毒棘豆是引起草地毒草化的主要植物类群,给草地环境和农牧经济发展带来了严重危害。目前研究已经证实在多数棘豆毒草中,苦马豆素是由与植物共生的内生真菌U.oxytropis产生的。但是目前,内生真菌及苦马豆素含量受何种因素影响还不得而知。因此,有必要从分子水平明确棘豆属植物在物种水平的遗传分化背景,揭示植物遗传分化背景、地理距离、环境因素、内生真菌Undifilum oxytropis、苦马豆素五者之间的相关性。此工作可为阐明棘豆毒草的发生规律,减少其对畜牧业的危害提供一定的理论依据。本研究通过采集我国西部草原地区的19个常见棘豆种为研究对象,借助简化基因组测序(SLAF-seq)、生化测定、相关性分析、GWAS分析等手段开展了三个方面的工作,主要研究内容及结果如下:1、揭示了我国常见棘豆属植物自然居群的遗传进化背景。利用SLAF-seq技术对我国西北地区的19个棘豆种,共计196个棘豆个体进行测序,共获得7473950个高质量的SNP标记,群体平均杂合度为5.37%。随后基于开发获得的SNP位点信息,对棘豆属植物物种水平上的遗传背景进行调查,获得的主要研究结果如下:(1)棘豆物种遗传多样性分析结果表明:19个棘豆物种间的遗传多样性差异较大,棘豆物种间平均观测等位基因数(Ao)、期望等位基因数(Ae)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Nei’s多样性指数(h)、香浓指数(I)、多态性信息含量(PIC)分别为1.207、1.099、0.038、0.060、0.066、0.092、0.048,其中小叶棘豆[O.microphylla(Pall.)DC.]、胀果棘豆(O.stracheyana Benth.)的遗传多样性最高,米尔克棘豆(O.merkensis Bunge)遗传多样性最低,推测可能是由于小叶棘豆、胀果棘豆所属的青藏高原地区具有复杂的地势和多变的气候条件,导致了群体之间为了适应更加复杂的环境从而进化出较高水平的遗传多样性,同时胀果棘豆的多倍化现象也可能是影响其遗传多样性较高的重要因素之一;而米尔克棘豆的较低水平遗传多样性可能与其采样数目最少、种群最小、样品来源单一等情况有关,因为研究证明遗传漂变在小种群中作用更迅速,总体而言小种群一般倾向于具有较低水平的遗传多样性。(2)AMOVA分析棘豆属物种遗传变异结果表明:棘豆物种间的遗传变异(71.37%)是棘豆属物种遗传变异的主要来源,且物种间呈现显著地遗传分化现象(Fst=0.71370>0.25);群体近交系数Fis=-0.19506<1,说明自然状态下棘豆属植物生殖以异交为主,推测低效的种子传播方式、地理隔离、人为活动的干扰等因素加大了群体间的遗传分化。(3)群体基因流分析结果表明:小叶棘豆与胀果棘豆、胀果棘豆与镰形棘豆、华西棘豆与黑萼棘豆、多叶棘豆与二色棘豆、小叶棘豆与毛瓣棘豆、砂珍棘豆与黄毛棘豆这几个物种间的基因交流频繁,种群能够成为互相连接的单元,共同促进物种的进化;大多数物种间基因流Nm<1,棘豆属物种间平均基因流Nm=0.1002<1,说明棘豆物种间基因交流程度较低,遗传漂变可能会引起物种彼此间在遗传上发生分化。(4)群体遗传结构结果表明:通过系统发育分析、群体遗传结构分析和主成分分析(PCA)三种方法对棘豆物种及个体之间的亲缘关系及群体遗传结构分析结果均显示19个棘豆属物种以boostrap=93%在进化上分成了两个大的分支;利用admixture软件分析群体遗传结构显示最佳分类群K=15,可直观的观察到毛瓣棘豆与小叶棘豆、冰川棘豆与胀果棘豆、镰形棘豆与胀果棘豆、二色棘豆与多叶棘豆、黄毛棘豆与砂珍棘豆、黑萼棘豆与华西棘豆之间遗传背景相似,可能存在基因渐渗。2、分析棘豆属植物的内生真菌U.oxytropis、苦马豆素的关系。(1)通过qPCR方法对19个棘豆属植物内生真菌U.oxytropis进行定量分析,首次证实了前期研究所广泛使用的qPCR检测U.oxytropis含量的方法存在局限性,即19个物种中黄花棘豆和甘肃棘豆两个物种的样品经实验证明此方法对其并不适用,推测qPCR方法的适用性与实验所选样品有很大的关系,对样品存在一定的选择性。不同棘豆属物种间,内生真菌的含量存在显著性差异,其中对黄毛棘豆、华西棘豆、多枝棘豆、小叶棘豆、胀果棘豆、米尔克棘豆、黑萼棘豆、二色棘豆这8个物种的内生真菌检测是首次报道。(2)利用LC-MS检测19个棘豆属植物主要毒性成分——苦马豆素含量,结果表明:来自不同采集范围及地理环境的大多数棘豆物种内单个样品间其内部毒性成分——苦马豆素含量存在很大差异且达到显著水平,推测这种差异性结果可能与样品的地理位置、气候环境、土壤微生物等因素的共同作用有关。另外,我们首次在小叶棘豆、黑萼棘豆、黄毛棘豆、胀果棘豆、华西棘豆、多枝棘豆、多叶棘豆、米尔克棘豆这8个物种中展开毒性研究,实验中我们也根据毒性界限和化学型标准对19个棘豆物种进行划分揭示其毒性大小,差异性分析显示苦马豆素的含量在棘豆属物种间存在显著性差异。(3)17个的棘豆物种样品苦马豆素与内生真菌的进行相关性分析结果表明,两者之间存在显著正相关性(r=0.652,P<0.01),说明棘豆属植物中内生真菌的侵染与植物次生代谢产物苦马豆素之间存在紧密关联。3、阐述棘豆属植物的遗传距离、地理距离、海拔、环境因子、内生真菌、苦马豆素之间的关系。(1)利用Mantel检验和Spearman检验方法在物种水平上对几个因素进行相关性分析结果表明:棘豆属植物苦马豆素的含量、内生真菌含量与某些环境因子、海拔、地理距离呈现显著相关性,从侧面说明地理环境因素可能对棘豆毒草的内生真菌侵染、苦马豆素代谢等功能强弱会产生一定影响;植物遗传距离矩阵与地理距离、7个环境因子、海拔之间呈现显著的正相关性,说明地理环境、海拔梯度差异可能对棘豆物种间的遗传变异产生了一定的影响作用;属内遗传距离矩阵与苦马豆素含量、内生真菌含量两个因素之间的相关性很低,可能与我们在相关性分析过程中按照种属及采样点这两个要素分组分析有关。(2)利用全基因组分析(GWAS)方法关联到与苦马豆素的含量显著相关的38个SNP位点,其中22个SNP位点与各种功能数据库比对得到注释结果。后续的研究中,我们将对这注释到的22个分子标记序列与本实验组此前研究获得的黄花棘豆转录组数据库及已报道的苦马豆素合成通路相联系展开更加深入的研究。
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