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研究背景全球范围内,肺癌的发病率和死亡率仍然在所有癌症中位居首位,近年来在我国肺癌发病率不断增加,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌总数的80%左右。以往晚期NSCLC的治疗主要以含铂化疗为主,然而随着EGFR-TKI药物的出现,大幅度提高了EGFR敏感突变患者的生存期,但继发性耐药是EGFR-TKI治疗后出现的最大问题。对于哪些EGFR-TKI耐药患者可以从EGFR-TKI联合含铂化疗方案中获益以增加治疗敏感性延长生存期,目前没有明确的分子分型,临床研究也存在不同的结论,比如大样本临床研究提示EGFR-TKI联合含铂化疗不存在协同性,但也有很多临床报道部分耐药患者可以从EGFR-TKI联合含铂化疗中获益,说明EGFR-TKI联合含铂化疗的协同作用存在选择性,存在一部分敏感人群,但就目前以单一的EGFR基因分型不能精准的去预测筛选出有效人群。这归因于我们对EGFR-TKI联合含铂化疗的协同作用机制了解甚少,特别是对含铂化疗的核心药物顺铂与EGFR-TKI的相互作用机制仍尚不清楚。所以本研究将对吉非替尼与顺铂的联合作用进行研究,并探讨它们在EGFR-TKI耐药型NSCLC中的协同作用机制。实验方法及结果我们选取三株EGFR-TKI耐药型NSCLC细胞系(H1299、A549和H1975)作为研究模型,先通过PCR扩增及测序获得EGFR第18-21外显子和K-ras第2-3外显子基因序列,验证H1299细胞EGFR和K-ras基因均为野生型,A549细胞为EGFR野生型、K-ras exon-2-G12S突变型,H1975细胞为EGFR exon-21-L858R, exon-20-T790M突变型、K-ras野生型。通过MTT法和AV/PI流式细胞技术测得三株细胞对吉非替尼均为耐药型,对顺铂的敏感性较低。我们进一步对三株细胞系同时联用吉非替尼和顺铂,用MTT法和Chou-Talalay中位药效法计算各株细胞的联合指数,发现吉非替尼联合顺铂对H1299细胞是协同作用,对A549细胞是混合效果(即低浓度时为拮抗作用,高浓度时为协同作用),对H1975细胞则是拮抗作用。通过MTT法、细胞3D培养及AV/PI细胞流式检测,发现吉非替尼预处理只能够增强顺铂对H1299细胞和A549细胞的抗肿瘤及诱导凋亡能力,对H1975细胞则没有效应。动物模型实验也验证了顺铂联用吉非替尼对H1299和A549细胞肿瘤有协同抑瘤作用,但对H1975细胞没有协同作用。Western blot实验也证实,吉非替尼预处理后顺铂能更显著诱导H1299细胞和A549细胞的caspase-3和cleaved caspase-3的表达,但对H1975细胞没有此效应。提示吉非替尼联合顺铂的协同作用可能依赖于吉非替尼增敏顺铂的作用,其具有选择性。然后,我们对吉非替尼增强顺铂敏感性机制进行了研究。通过PCR扩增及测序对移植瘤组织的EGFR和K-ras基因重新测序发现顺铂对组织的EGFR和K-ras基因状态没有影响。用Western blot检测发现顺铂联合吉非替尼对H1299、A549和H1975细胞的EGFR/Akt/Erk/PTEN/BRCA1/RECC1表达或激活作用没有差异,但吉非替尼能选择性抑制H1299与A549细胞的DNA-PK的磷酸化表达,而不能抑制H1975细胞的。用MTT法检测细胞活力,发现细胞被DNA-PK抑制剂NU7441刺激后,吉非替尼对H1299和A549细胞增敏顺铂作用消失,对H1975细胞没有影响。免疫共沉淀法检测发现非小细胞肺癌中EGFR与DNA-PK存在相互结合作用,H1299和A549细胞的EGFR与DNA-PK的结合作用可以被吉非替尼所抑制,但H1975细胞不能。免疫荧光标记法显示,吉非替尼可以阻止H1299和A549细胞的EGFR进入细胞核内与DNA-PK结合,而对H1975细胞无此效应。Western blot检测发现吉非替尼能使H1299和A549细胞的核EGFR表达降低,而对H1975细胞无作用。结论吉非替尼联合顺铂对部分EGFR-TKI耐药型非小细胞肺癌有协同抗肿瘤作用。吉非替尼联合顺铂的协同作用可能依赖于吉非替尼选择性增敏顺铂的效应。吉非替尼能否阻止EGFR进入细胞核从而抑制DNA-PK活化决定了吉非替尼与顺铂联合是否有协同作用,而单一的EGFR或K-ras基因状态不足以筛选出这部分有效人群,只有充分了解了吉非替尼抑制EGFR入核的选择机制后或许能找出可以预测联合治疗有效性的筛选指标。本研究为探索含铂化疗联合EGFR-TKI的有效性筛选指标提供了新思路。