第一部分Smo蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义目的:胃癌是最为常见的恶性肿瘤之一,在我国胃癌的患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍多,且仅次于肺癌为第二大恶性肿瘤。最近研究发现,信号通路是诱发细胞癌变的重要因素,信号通路在胚胎生长进程中发挥着异常重要的调控功能。关于Sonic hedgehog信号通路方面的研究是现今热点之一,相关数据表明,胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌等恶性肿瘤的发生与Sonic hedgehog信号通路的异常激活有着紧密关系。Sonic hedgehog信号通路是由Shh配体(分泌型信号糖蛋白)、Ptch(跨膜蛋白)、Smo(跨膜蛋白)、Gli蛋白(下游转录因子)所共同构成的复合物。现有研究证实,主要有两种方式会导致该信号通路被异常激活:1)配体非依赖性,即信号通路成员基因突变:如smo基因产生功能获得性改变或Ptch基因产生功能缺失性改变而使其被异常激活;2)配体依赖性,即配体高表达:如肿瘤细胞或细胞外旁Shh配体的表达出现异常,并且和Ptch受体相结合,进而使得信号通路被异常激活。临床研究显示,在胃癌细胞中表达大量的Shh和Ptch,这表明Sonic hedgehog信号通路的异常激活是导致胃癌发生的重要原因,且通过大量的试验发现,配体依赖性方式可能为主要的异常激活因素,但到目前为止,尚缺乏足够的研究来阐明在此方式中Ptch基因在信号通路中高表达的问题。Smo蛋白可被形象比喻为信息转换器,Shh通过其转变为Gli信号,进而使得细胞核当中的基因被转换,从一定程度上激活了Sonic hedgehog信号通路。大量的研究表明,Smo发生功能获得性突变与罹患基底细胞癌相关,在家族及散发性的基底细胞癌中Smo有20%突变几率。但Smo突变是否会诱发胃癌,由Smo基因突变所导致的配体非依赖性方式是否是激活胃癌细胞组织当中的Sonic hedgehog信号通路的原因,目前尚未取得一致意见。本部分作为本研究的第一部分,主要旨在探究Smo蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法:自河北医科大学第二医院选取85例手术切除胃癌病理标本及20例同期正常胃组织标本,共105例创建组织细胞芯片,利用免疫组化来检测Smo蛋白及Smo mRNA在胃癌细胞中的表达程度,并分析胃癌细胞中Smo基因的突变程度和病变发生部位、临床病理分期间的关系问题。结果:研究显示,20例正常胃组织中Smo蛋白的表达率是25%,其中80%呈现弱阳性,7例胃乳头状腺癌中为85.7%,在高、中、低分化管状腺癌(分别为9、26、18例)当中依次为88.9%、92.3%、94.4%,染色强阳性率分别为25%、25%和35%;在11例胃粘液腺癌当中其表达率为54.5%,其中83.3%呈现弱阳性;在14例印戒细胞癌当中则是28.6%,100%呈现出弱阳性特征。从以上数据中可看出,在胃乳头状腺癌,高、中、低分化管状腺癌当中Smo蛋白的表达水平明显高于正常胃组织,在统计学上有显著性差异(χ~2=52.17,P<0.001,均值分别为60.43、61.37、69.15及72.21);而在胃粘液腺癌及印戒细胞癌当中Smo蛋白的表达率与正常胃组织差异无统计学意义;此外,正常及胃癌组织中Smo mRNA和Smo蛋白的表达水平显示出正相关关系;临床病理分期不同,胃癌细胞中的Smo蛋白表达水平也不尽相同,III、IV期胃癌组织中的Smo蛋白表达水平明显要高于I期(χ~2=8.64,P<0.05),且随着临床病理分期的升级,Smo蛋白的表达水平亦逐渐升高。小结:Smo的表达和胃腺癌特别是乳头状腺癌,高、中、低分化管状腺癌等组织病理类型的发生有密切关系,Smo高表达可诱发细胞癌变,其表达水平的高低与肿瘤分期及病情轻重相关。第二部分Smo蛋白及其下游转录因子Gli1蛋白在胃癌组织中表达的相关性分析目的:探索Smo蛋白及其下游转录因子Gli1蛋白在胃癌组织中表达的相关性。方法:利用之前创建的胃癌组织芯片,应用免疫组化方法检测胃癌细胞当中的Gli1蛋白的表达水平,积极探究该表达水平和胃癌疾病种类间的关系问题,并参考第一部分Smo蛋白的相关数据,分析胃癌细胞当中Smo与Gli1蛋白表达相关性问题。结果:研究显示,20例正常胃组织中Gli1蛋白的表达率是20%,其中75%为弱阳性;在7例胃乳头状腺癌当中其表达率是100%,其中28.6%为强阳性;在高、中、低分化管状腺癌(分别为9、26、18例)当中其表达率依次是77.8%、96.2%、100%,其中强阳性率分别为28.6%、28%和61.1%;在11例胃粘液腺癌当中其表达率是27.3%,其中66.7%为弱阳性;在14例印戒细胞癌当中其是21.4%,100%呈现出弱阳性。可以看出,胃乳头状腺癌,高、中、低分化管状腺癌当中的Gli1蛋白表达水平明显高于正常胃组织,差异具有统计学意义(χ~2=67.02,P<0.001);在胃粘液及印戒细胞癌当中该蛋白的表达水平和正常的胃组织无显著性差异;在本研究标本中,Smo与Gli1蛋白的表达呈现出显著的正相关关系,相关系数是0.8609。小结:Gli1作为Smo的下游基因,其在胃乳头状腺癌,高、中、低分化管状腺癌当中高表达,与Smo在对应组织中的表达一致,二者之间为正相关关系,从一个层面揭示出胃癌组织中Sonic hedgehog信号通路中主要成员的表达状态。第三部分Smo蛋白在人胃癌MGC803细胞的表达及小RNA干扰Smo蛋白表达对胃癌MGC803细胞增殖及凋亡的影响目的:探索Smo在人胃癌MGC803细胞的表达及小RNA干扰Smo表达对胃癌MGC803细胞增殖及凋亡的影响。方法:利用蛋白质印迹法(Western blot)和半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)来检测胃癌细胞MGC803当中smo蛋白和Smo mRNA的表达水平;首先人工合成3对针对Smo mRNA的特异性干扰RNA(siRNA),利用阳离子脂质体方式将siRNA介导转染癌变MGC803细胞内,应用半定量RT-PCR检测Smo siRNA序列对于MGC803细胞的干扰效果;此外,应用Western blot、流式细胞等方法检测降解Smo mRNA后MGC803中Gli1蛋白的表达水平,对比其变化,探究其对MGC803繁殖及凋亡的影响。结果:在胃癌细胞MGC803中,Smo蛋白、Smo mRNA呈现出高表达;在三对特异性siRNA当中,siRNA-1的干扰功用最为显著,是61.7%,siRNA-2的是41.2%,而si RNA-3干扰作用甚微;当沉默Smo基因后,胃癌细胞当中的Gli1表达下降,其中Gli1 mRNA下降至56.2%,Gli1下降至61.3%;同时MGC803细胞在转染24小时后其增殖速度减缓,在转染48小时后癌细胞的凋亡率升为23.6%,凋亡速度较前升高。结论:在胃癌细胞MGC803中Smo基因高表达,与前部分研究相符;利用小RNA干扰技术沉默Smo mRNA可以有效降低Gli1 mRNA及蛋白的表达水平,从另一层面印证Smo及Gli1在信号通路中上下游的关系;Smo基因和MGC803细胞的繁殖及凋亡密切相关,抑制其表达可在一定程度上减慢胃癌细胞的增殖及加快其凋亡速率。第四部分Sonic Hedgehog信号通路对胃癌细胞侵袭运动能力的影响目的:探索Sonic Hedgehog信号通路对胃癌细胞侵袭运动能力的影响。方法:利用不同浓度环巴胺(Cyclopamine,Hh信号抑制剂)处理胃癌细胞MGC803后,观察24h、48h、72h细胞划痕愈合情况,并检测穿透Transwell小室半透膜及基底膜的细胞数量来观察细胞的运动和迁徙能力,最后通过Western blot方法测定钙黏附蛋白-E(E-cadherin)的表达情况,探讨以Smo及Gli1为关键的Sonic Hedgehog信号通路与胃癌浸润和转移之间的关系。结果:随着cyclopamine浓度的提高(2、5、l0μM),细胞的迁移率逐渐降低,愈合能力也逐渐下降。l0μmo1/L的cyclopamine具有显著的抑制癌细胞的作用,细胞愈合率从空白组的78.51±3.04%减少至23.31±0.83%;穿过Transwell小室半透膜的平均细胞数从空白组的2204±47.9减少至523±16.5。Western blot结果提示E-cadherin在胃癌MGC803细胞中低表达,但当应用cyclopamine来抑制Smo表达,阻断信号通路后,其表达水平有所提高。小结:Cyclopamine可通过抑制SHH信号通路中的Smo及其下游基因Gli1,降低E-cadherin的表达,减缓胃癌细胞的运动能力,从而降低胃癌细胞的侵袭转移能力。结论:1.Smo表达水平升高与胃乳头状腺癌,高、中、低分化管状腺癌的发生有密切关系,其表达水平的上升因与分期正相关,可在一定程度上提示疾病严重程度。2.Gli1作为Smo的下游基因,其在胃乳头状腺癌,高、中、低分化管状腺癌当中高表达,与Smo在对应组织中的表达一致,二者之间为正相关关系,从一个层面揭示出胃癌组织中Sonic hedgehog信号通路中主要成员的表达状态。3.在胃癌细胞MGC803中,利用小RNA干扰技术沉默Smo mRNA可以有效降低Gli1 mRNA及蛋白的表达水平,从另一层面印证Smo及Gli1在信号通路中上下游的关系;Smo基因和MGC803细胞的繁殖及凋亡密切相关,抑制其表达可在一定程度上减慢胃癌细胞的增殖及加快凋亡。4.Cyclopamine可通过抑制SHH信号通路中的Smo及其下游基因Gli1,提高E-cadherin蛋白的表达,减缓胃癌细胞的运动能力,从而降低胃癌细胞的侵袭转移能力。5.Smo基因及其下游转录因子Gli1在胃癌中高表达,并在胃癌的发生和发展过程中有着重要的临床病理意义。