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共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)通常是指含有顺式或反式共轭双键的一系列构型和位置异构的亚油酸的总称。CLA具有丰富的营养价值,不同的异构体也具有不同的生理功能,如c9,t11-CLA具有抑癌作用,而t10,c12-CLA则能够预防糖尿病和减肥。本研究以从黄牛瘤胃中筛选到的四株具有亚油酸异构酶活性的乳酸菌为出发菌株,通过PCR扩增得到LAI基因后,构建了四株原核工程菌,并利用PCR-RFLP技术对得到的LAI基因进行多态性分析。实验结果如下:1.亚油酸异构酶原核工程菌的构建及表达:本实验室从黄牛瘤胃中分离得到四株具有将LA转化为CLA能力的乳酸菌,通过PCR技术扩增得到LAI基因,PCR产物克隆到pUCm-T质粒中,得到重组质粒(pUCm-T-LAI),经PCR鉴定、酶切分析和克隆测序鉴定克隆成功后,亚克隆至表达载体pET-DsbA中,构建重组表达载体(pET-DsbA-LAI)并转化到E.coli DH5α中,经PCR鉴定与酶切分析证明重组表达载体(pET-DsbA-LAI)构建成功后,转化到E.coli BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌株表达了大小约为85 kDa的融合蛋白(LAI:64 kDa;DsbA:21kDa)。2.重组菌株的诱导条件优化:对重组菌株诱导表达过程中的诱导剂浓度、诱导时间、诱导时机、诱导温度分别进行了单因素试验,结果发现,BL21(pET-DsbA-206-LAI)重组菌株的最佳诱导条件为:诱导时机选择为培养7 h后进行诱导;诱导时间为15 h;诱导温度为30℃;诱导剂IPTG的最终浓度为100μg/mL;BL21(pET-DsbA-Fx-LAI)重组菌株的最佳诱导条件为:诱导时机选择为培养10 h后进行诱导;诱导时间为15 h;诱导温度为25℃;诱导剂IPTG的最终浓度为100μg/mL。3.亚油酸异构酶基因的多态性分析:对四株乳酸菌的LAI基因进行多序列比对,结果发现两株植物乳杆菌LAI基因的相似性高达99.5%,两株干酪乳杆菌LAI基因的相似性也高达99.8%。而植物乳杆菌LAI基因与干酪乳杆菌LAI基因的相似性仅为40.9%。用NdeⅠ、DraⅠ、EcoRⅠ对LAI基因分别进行单酶切发现,植物乳杆菌LAI基因有两个NdeⅠ酶切位点,而干酪乳杆菌LAI基因只有一个NdeⅠ酶切位点;植物乳杆菌LAI基因和干酪乳杆菌LAI基因均只有一个DraⅠ酶切位点;植物乳杆菌LAI基因没有EcoRⅠ酶切位点,而干酪乳杆菌LAI基因却有两个EcoRⅠ酶切位点。两个结果都证明了不同菌株的亚油酸异构酶基因均存在着一定的差异。