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甘遂（Euphorbia kansui Liou）为大戟科大戟属（Euphorbia）的多年生草本植物,为我国特有药用植物。在临床上多用于胸腔积液、肝硬化腹水、咳喘、水肿、肿瘤等病症,其主要药用成分包括萜类（二萜类、三萜类化合物）、甾体类和黄酮类化合物。黄酮类化合物合成途径是植物体内重要的代谢途径之一,对于植物自身生长发育及抵抗外界非生物胁迫具有重要意义。此外,临床研究证明多种植物中的黄酮类化合物具有抑菌、抗肿瘤活性、防治糖尿病肾病及调节血脂等作用,被广泛应用于工业生产及医药健康领域,具有重要的科研价值与商业价值。植物的次生代谢产物合成受到环境因素和信号激素的影响,茉莉酸类化合物是一种典型的信号调控分子,作为一种新型植物内源激素,被发现可以调控植物黄酮类物质的合成代谢。许多文献报道大戟科植物中黄酮类物质主要是黄酮醇,黄酮醇是黄烷酮的衍生物,由黄酮醇合成酶（FLS）催化形成,FLS是合成植物黄酮类化合物的关键酶之一。然而,茉莉酸类化合物对甘遂黄酮类化合物积累及相关酶基因表达的影响,Ek FLS基因在黄酮类化合物合成途径中的功能以及对植物在非生物胁迫耐受中的调控机制尚未展开系统的研究。为此,本研究以甘遂作为研究对象,分析茉莉酸甲酯（Me JA）对甘遂黄酮类化合物积累及相关酶表达的影响,克隆Ek FLS基因并进行信息学分析和原核表达,然后将Ek FLS基因转入拟南芥（Arabidopsis thaliana）,通过过表达Ek FLS基因以及相应的胁迫处理分析,阐明其基因功能,为深入研究FLS基因的分子调控机制以及植物抗逆的分子机理,提高植物黄酮类化合物含量及增强植物抗逆性提供理论基础。研究结果如下:1. 使用100μmol/L的Me JA处理甘遂,通过紫外分光光度计法测量处理组和对照组根、茎、叶不同部位的总黄酮含量。结果表明,不同组织的总黄酮含量存在显著差异,其中叶片中总黄酮含量最高,平均为2.286 mg/g,其次是茎（平均含量为0.428 mg/g）和根（平均含量为0.184 mg/g）。Me JA诱导后,叶片总黄酮含量增加2.4%-23.8%,处理后36 h达到最大值;根中总黄酮含量增加24.4%-73.3%,处理后12 h达到最大值;茎中总黄酮含量变化不明显。此外本研究提取了甘遂中的黄酮醇,通过薄层分析法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）分析发现甘遂内含有槲皮素和山奈酚两种黄酮醇产物,含量分别为0.128 mg/g和2.165 mg/g。2. 通过甘遂转录组数据库（NCBI Sequence Read Archive database:SRP126436）筛选出黄酮合成途径中的五个关键酶基因:查尔酮合成酶（CHS）、花青素合成酶（ANS）、二氢黄酮醇还原酶（DFR）、查尔酮异构酶（CHI）和黄酮醇合成酶（FLS）,采用RT-q PCR技术分析Me JA处理不同时间后的表达水平,结果表明Ek CHS（unigene 045546）、Ek CHS（unigene 052162）、Ek DFR（unigene080108）、Ek DFR（unigene 080109）、Ek FLS（unigene 078670）、Ek ANS（unigene075390）等均显著上调,于处理后12 h-36 h表达量最高;Ek ANS（unigene 075388）在处理后3 h表达量显著下降,然后逐渐恢复正常;Ek CHI（unigene 040233）没有明显的趋势变化。3. 从甘遂转录组（NCBI Sequence Read Archive database:SRP126436）序列中找到FLS的编码序列（CDS）,利用RT-PCR和基因特异性引物克隆了大戟甘遂的Ek FLS全长基因。随后成功进行了载体构建:p DE1:T7-His-FLS（用于原核表达）;p CAMBIA1300:35S-FLS（用于转基因过表达）。4. 为了进一步了解Ek FLS的作用机制及其编码蛋白的信息,对Ek FLS进行了生物信息学分析:该基因CDS区全长1023 bp,编码的FLS蛋白包含340个氨基酸,分子量为38.67 k Da,等电点（p I）为6.19。该蛋白属于黄酮醇合成酶超家族,是以α-螺旋和不规则卷曲为主要结构元件,定位在细胞质中的酸性非跨膜蛋白。进化树分析表明Ek FLS与来自柑橘属的FLS蛋白质同源关系较近,且进化程度高于这些植物;原核表达SDS-PAGE分析结果表明,Ek FLS蛋白分子量约为38.5 k Da,与预测值一致,该蛋白原核表达的最优条件为:培养基占锥形瓶容积10%,菌体生长至OD600=0.9,加入终浓度0.6 mmol/L的IPTG,37℃诱导6 h。5. 将Ek FLS的编码区在35S启动子的控制下克隆到载体中,通过农杆菌转化拟南芥,获得转基因植株。为了进一步证明Me JA对植物类黄酮调控的作用,本研究采用100μM Me JA处理转基因拟南芥,结果表明Me JA有效上调了拟南芥中黄酮合成通路相关基因的表达及类黄酮的积累。此外,利用Me JA处理,并用Na Cl和PEG模拟外界高盐、干旱环境,转基因型拟南芥黄酮合成通路相关基因的表达量、POD和SOD基因的表达量以及POD和SOD的酶活性都被显著上调,类黄酮的含量也明显升高。说明过表达Ek FLS拟南芥通过提高类黄酮合成及ROS清除通路的关键酶转录表达水平,增加总黄酮及黄酮醇含量的积累,增强抗氧化酶活性以增强植物的抗氧化性,从而提高了植物的Me JA的耐受性以及耐盐耐旱性。