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机体抵抗结核杆菌感染的免疫应答,需要有能够清除结核杆菌的巨噬细胞参与的固有免疫反应来协同完成。巨噬细胞上的Toll样受体(TLRs)通过识别病原体特有的模式分子结构,激活固有免疫反应(例如诱导TNF-α,IL-6等细胞因子产生),并进一步通过抗原递呈作用调节获得性免疫,这对抗结核的免疫应答非常重要。结核杆菌的某些成分会以TLRs的配体形式来干扰宿主TLRs介导的免疫反应。其中很重要的一类成分就是脂蛋白,例如19kDa,38kDa等脂蛋白,通过与细胞表面的TLR2结合,激活MAPKs信号通路或NF-κB等核转录因子,从而上调巨噬细胞的某些细胞因子的转录水平,同时加强或减弱MHCⅡ类分子的表达,加强或弱化巨噬细胞将抗原肽递呈给T淋巴细胞识别的能力。本论文的研究结果表明,结核杆菌MPT83蛋白刺激巨噬细胞,能够增强巨噬细胞内TNF-α,IL-6和IL-12p40细胞因子的转录和表达。TNF-α在结核感染的肉芽肿形成和细胞毒性产生中具有重要作用。而IL-12能激活Th1型细胞免疫应答,有效地抵御结核感染。当巨噬细胞膜上TLR2受体被其特异性抗体封闭后,MPT83上调的细胞因子的转录水平和表达水平均大大减低,表明MPT83诱导细胞因子产生是依赖于TLR2信号通路的激活。当用蛋白酶k或特异的抗体预处理后的MTP83蛋白对巨噬细胞进行刺激时,均不能诱导以上三种细胞因子生成。进一步利用正常C57BL/6小鼠和TLR2-/-小鼠来源的巨噬细胞进行实验,发现MPT83能诱导正常小鼠来源巨噬细胞分泌高水平的细胞因子,而在TLR2-/-小鼠来源的巨噬细胞中诱导的细胞因子水平却很低,验证了细胞系中TLR2抗体封闭实验的结果。有趣的是,已有报道结核杆菌的致病性和它们所能诱导的IL-12,TNF-α的水平是呈负相关的。巨噬细胞生成NO是抵御外来病原感染的一项主要的免疫保护机制,我们的实验还表明MPT83蛋白能诱导巨噬细胞释放较高水平的NO,有利于机体抵御外来病原感染。 MPT83蛋白能够结合在稳定转染了TLR2基因的HEK293-TLR2细胞的表面,诱导细胞分泌IL-8,而在空载体转染细胞或TLR4基因稳定转染细胞中均未观察到MPT83蛋白的结合以及细胞因子IL-8的分泌,表明MPT83蛋白作为TLR2的配基发挥着刺激巨噬细胞的作用。免疫共沉淀实验证实了未经糖基化或酰化修饰的MPT83重组蛋白也能与TLR2直接结合,同其他的诸如ESAT6,PPE18,MPB83等结核杆菌重组蛋白和TLR2结合的相关研究结果是一致的。TLR2蛋白富含亮氨酸重复序列的胞外结构域参与了受体和配体之间的相互作用,利用ZDOCK server模拟MPT83作为配体,TLR2作为受体的复合物结构,模拟时限制TLR2空腔中的残基不参与配体的结合。发现MPT83主要作用于TLR2的LRR10-15的区域。 TLR2激活后的信号传导依赖于MyD88,IRAK和TRAF6等接头分子,以及MAPKs信号通路及NF-κB信号通路的激活。利用MyD88-/-小鼠进行的研究证实了MPT83蛋白诱导的TLR2信号通路的激活依赖于MyD88。进一步的激酶磷酸化实验表明MPT83蛋白诱导MAPKs家族三个蛋白激酶p38、ERK及JNK的磷酸化。已证实p38通路介导了LPS诱导单核细胞分泌TNF-α,IL-1等细胞因。而各通路的抑制实验表明,MPT83蛋白诱导的TNF-α,IL-6和IL-12p40三种细胞因子的产生主要依赖于p38和JNK信号通路的激活。 NF-κB是TLR信号通路激活中起主要作用的一类转录因子。相关研究表明DC细胞中NF-κB通路的抑制激活会降低MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子的表达,从而不能有效的激活T淋巴细胞。本论文的研究表明,MPT83蛋白能够激活NF-κB信号通路,促进NF-κB的抑制子IκBα从NF-κB上解离,随着活化的NF-κB的入核转运,IκBα在胞浆中降解。活化的NF-κB转运入核后便启动下游受调控基因的表达,如TNF-α,IL-6等细胞因子及MHC-Ⅱ类分子的表达等。 IFN-γ在结核感染的控制中有着很重要的作用。IFN-γ信号通路的缺陷可能引起小鼠或人体严重的结核感染。许多研究表明,结核杆菌的慢性感染很大程度上是由于它能抑制IFN-γ调控的系列基因的表达。而本研究发现,结核杆菌的MPT83蛋白24小时或48小时刺激巨噬细胞.均能增强IFN-γ诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞系或原代巨噬细胞表面MHC-Ⅱ类分子的表达。进而增强了巨噬细胞将MPT83抗原肽递呈给特异性CD4+T细胞识别的能力。MPT83蛋白增强的巨噬细胞表达MHC-Ⅱ类分子和抗原递呈能力的提高很大程度上也是由TLR2信号通路所介导的。这些结论通过抗体封闭实验和TLR2缺失小鼠的实验获得的。IL-2是抗原激活的CD4+T细胞在初次免疫应答时分泌的一类细胞因子,它能够通过增加抗原的敏感性和效应细胞因子的表达来增强细胞二次免疫应答的记忆和效应能力。MHC-Ⅱ类分子限制的CD4+T细胞在机体抗结核感染的免疫中起着关键的作用,所以说巨噬细胞表面的MHC-Ⅱ类分子的增强表达会是抵抗结核感染的另一个有效的应答策略。 Ting等人的研究证实了结核杆菌抑制IFN-γ的转录并不是通过STAT1蛋白的激活。本研究也证实MPT83是通过增强细胞表面IFN-γR的表达而没有抑制IFN-γ诱导的STAT1的磷酸化,暗示了MPT83增强的IFN-γR诱导的信号激活很可能是发生在通路的终端一一参与了染色体重塑的过程。CIITA是调控MHC-Ⅱ类分子的转录的重要反式作用子,其转录水平上的诱导很大程度上是依赖于启动子区染色体结构的变化,并且已有研究证实IFN-γ刺激细胞能引起CIITA基因座上染色体的重塑。本研究发现MPT83能增强IFN-γ诱导的CIITA的转录水平,表明MPT83参与了IFN-γ调控的相关基因的终末端调控。已有研究表明,结核杆菌的一些脂蛋白,如:19kda蛋白,长时间激活巨噬细胞的TLR2信号通路会下调IFN-γ诱导的MHC-Ⅱ类分子表达和抗原递呈能力。MHC-Ⅱ类分子的转录调控对结核感染的抗原递呈调控有着重要影响,MHC-Ⅱ类分子在免疫系统的发育和功能的发生中起了关键性的作用,除了将抗原肽递呈给CD4+T细胞之外,交联了抗原或超级抗原的MHC-Ⅱ类分子参与了许多免疫及非免疫细胞的激活。在本研究中,不论长时还是短时刺激,结核杆菌MPT83蛋白激活的TLR2信号通路都最终增强了IFN-γ诱导的MHC-Ⅱ类分子的表达并进而增强巨噬细胞的抗原递呈能力。以上结果和之前的疫苗的相关研究报道是相吻合的。MPT83蛋白作为免疫主导抗原能有效的增强疫苗对动物的免疫保护,而19kda蛋白作为主要的抗原进行免疫,则会降低疫苗的免疫保护效率。这也暗示了MPT83蛋白不同于其他已研究的结核杆菌蛋白。MPT83蛋白作为一种免疫主导蛋白,它能够被T淋巴细胞识别是由于它能增强CIITA基因的表达,从而上调MHC-Ⅱ类分子的转录表达,在宿主的免疫保护中发挥着重要的作用。而结核杆菌的19kda蛋白则通过抑制IFN-γ诱导的CIITA基因的染色体重塑,降低了MHC-Ⅱ类分子的反式作用因子的表达,从而下调MHC-Ⅱ类分子的表达,阻碍了CD4+T细胞的激活,有利于结核杆菌在巨噬细胞中的存活。 综上所述,本研究证实了MPT83蛋白作为TLR2的配体参与固有免疫应答,增强了小鼠巨噬细胞的抗原递呈等抗感染的免疫应答能力。 结论: 1、MPT83蛋白能够激活巨噬细胞系及原代巨噬细胞,并诱导其分泌TNF-α,IL-6,IL-12p40等细胞因子; 2、MPT83蛋白激活巨噬细胞主要是通过TLR2通路得以实现; 3、MPT83蛋白和TLR2结合后,激活下游的MAPK家族激酶磷酸化,其介导的细胞因子分泌主要是通过JNK及p38信号通路激活,而ERK信号通路的激活对IL-12p40的分泌有负调节作用; 4、MPT83蛋白可以增强RAW264.7细胞CD80,CD86等共刺激分子的表达及MHC-Ⅱ类分子的表达,并且表明它的刺激能增强抗原递呈细胞的抗原递呈能力; 5、动物巨噬细胞的吞噬功能也能被MPT83蛋白上调,并且MPT83蛋白诱导巨噬细胞凋亡,增强细胞抵御结核杆菌感染的能力; 6、动物实验进一步证实了MPT83蛋白从体液免疫及细胞免疫方面为机体提供免疫保护力。 创新点: 1、本研究首次报道了未经糖基化或酰化修饰的结核杆菌MPT83蛋白也能参与TLR2介导的宿主固有免疫信号通路的调节,并对MPT83蛋白参与调节的机制进行详尽阐述。 2、MPT83蛋白作为TLR2的配体,不同于其他已发现的结核杆菌脂蛋白(如19kda蛋白),它能通过提高CIITA启动子区的乙酰化水平,增强CIITA基因的转录,进而增强IFN-γ导的MHC-Ⅱ类分子的转录表达,从而有利于抗原递呈细胞将抗原肽递呈给T淋巴细胞识别。 3、作为结核杆菌新型疫苗研究的热门分子,MPT83蛋白和另一种“明星”分子-ESAT6蛋白相似,都能为机体提供有效的免疫保护,但两者的作用机制可能不尽相同。特别地,在介导细胞的固有免疫应答上,MPT83蛋白和TLR2结合后起着正调控的作用,而ESAT6蛋白的作用恰恰相反。