论文部分内容阅读
香茶菜属（Isodon）植物是我国民间广泛使用的草药，多数具有抗菌消炎和抗肿瘤等功效。对映—贝壳杉烷类二萜化合物在香茶菜属植物中含量丰富，是这些植物抗肿瘤作用的主要活性成分。近年来的研究表明，对映—贝壳杉烷类二萜化合物通过诱导肿瘤细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。然而对映—贝壳杉烷类二萜化合物诱导肿瘤细胞凋亡的机制及其在细胞内的作用靶点，目前并不清楚；阐明此类化合物的抗肿瘤作用机制以及评价它们是否具有临床应用前景也有待更加深入和系统性的研究。本工作首先选择一系列C-20位没有被氧化的对映—贝壳杉烷类二萜化合物进行抗肿瘤活性筛选，结果显示所测化合物均能够抑制HL-60细胞增殖；结构-活性分析表明，化合物结构中五元环的共扼双键系统是其发挥抑制细胞增殖作用的关键基团。植物含量丰富的苞叶香茶菜庚素（melissoidesin G，MOG）是其中一个典型的对映—贝壳杉烷类二萜化合物。细胞增殖实验显示，MOG具有显著抑制HL-60细胞增殖的作用，IC50=1.98μM。通过对十种不同来源的人肿瘤细胞系的增殖抑制作用筛选发现，人白血病细胞对MOG最敏感。实验结果表明，MOG显著诱导白血病细胞系和原代急性髓细胞样白血病（AML）细胞凋亡，表现为磷脂酰丝氨酸外翻、subG1峰出现以及DNA断裂等。进一步研究表明，MOG处理导致了HL-60细胞内△Ψm的降低以及细胞色素C的释放，并降低抑凋亡蛋白Bcl-xL及MCL-1的表达水平，提示MOG诱导的靶细胞凋亡可能与线粒体损伤有关。另一方面，MOG介导的HL-60细胞内caspase-8和-9的活化提示：MOG可能通过同时激活线粒体途径和死亡受体途径，诱导caspase依赖性的细胞凋亡。化疗药物作用引起的细胞内氧化还原状态失衡是其诱导肿瘤细胞凋亡的重要机制。本研究发现，MOG能够迅速降低HL-60细胞内的GSH水平，并能够促进ROS生成，从而导致细胞内氧化还原状态失衡。实验结果还显示，含巯基的抗氧化剂能够完全阻断MOG诱导的△Ψm降低及其后来的细胞凋亡；而Caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK虽然能够完全阻断MOG诱导的细胞凋亡，却只能部分抑制△Ψm降低，提示MOG介导的氧化还原状态失衡是发生于△Ψm降低、caspases激活之前的上游事件。作为抗氧化药物，NAC和tBHQ预处理能够增加HL-60细胞内GSH含量，并显著抑制MOG诱导的HL-60细胞内的GSH水平降低及其介导的caspase依赖性细胞凋亡。相反，BSO通过抑制细胞内GSH合成，能够显著增强MOG诱导的GSH减少以及细胞凋亡。这些结果说明，GSH耗竭在MOG诱导的靶细胞凋亡过程中扮演着重要角色。此外，NAC阻断其他对映贝壳杉烷类二萜化合物的细胞毒作用，提示它们均通过诱导细胞内GSH耗竭的机制介导细胞凋亡。MOG作用引起的这种细胞内的GSH耗竭提示我们：MOG有可能通过诱导细胞内氧化还原状态失衡，增强三氧化二砷（As2O3）诱导细胞凋亡的能力。接下来的实验结果显示，MOG与As2O3联合处理导致了HL-60细胞以及AML细胞发生凋亡，而在相同条件下，它们对正常的外周血单核细胞（PBMC）没有诱发凋亡的作用。这些结果证实，MOG的确能够提高AML细胞对As2O3的敏感性，而并没有增加对正常细胞的毒副作用。综上所述，MOG能够通过诱导caspase依赖的靶细胞凋亡显著抑制白血病细胞的生长增殖。而在以MOG为代表的对映-贝壳杉烷类二萜化合物介导的细胞凋亡过程中，氧化还原状态的失衡（主要指GSH耗竭）起着非常重要的调控作用。此外，MOG抑制白血病细胞增殖及其协同As2O3促进AML细胞发生凋亡的作用提示，MOG单用或与其他抗肿瘤药物联用，可能为将来白血病的治疗提供新策略。