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支气管哮喘是人类常见的呼吸道疾病,是由多种细胞和细胞组份参与的气道慢性炎症性疾患。辅助T细胞亚群(Th1/Th2)失衡、Th2细胞的优势分化和气道对变应原诱导的免疫耐受能力减弱,是哮喘发病的重要因素和主要免疫病理特征。喘息性支气管炎是婴幼儿时期发生的一种特殊类型的支气管炎,具有哮喘样临床表现,国外将其归入哮喘。T-bet,是Th1细胞特异性转录因子,在Th1细胞分化中起核心作用。通过强力激活IFN-γ的基因转录,T-bet可诱导自身再表达,上调Th细胞表达IL-12Rβ2,以增强对IL-12的敏感性,加速IL-12诱导初始Th细胞向Th1细胞的分化,甚至在其他转录因子的协同作用下将分化中的Th2和已完全分化的Th2细胞逆转为Th1细胞,伴随大量的IFN-γ,产生,并抑制Th2细胞IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子的产生。T-bet还能直接抑制Th2细胞特异性转录因子GATA-3,进而抑制Th2细胞分化和促进Th1细胞分化。T-bet基因敲除小鼠可呈现类似哮喘表现的自发性气道高反应和气道炎症。本研究目的:一方面通过临床研究T-bet对婴幼儿喘息性支气管炎的免疫调控作用,探讨喘息性支气管炎的免疫病理特征及其与支气管哮喘的相互关系;另一方面,通过构建小鼠T-bet基因的腺相关病毒载体,模拟自然途径经鼻干预哮喘小鼠模型,探讨T-bet基因传递对支气管哮喘的免疫调节作用,包括对Th细胞平衡和气道炎症的影响、对调节性T细胞和B细胞的作用等。研究方法如下:(1)临床研究中,分别应用RT-PCR和western-blot方法检测喘息性支气管炎患儿外周血淋巴细胞T-bet和GATA-3的mRNA和蛋白表达水平,同时借ELISA测定相应淋巴细胞培养上清液中Th1类细胞因子IFN-γ、Th2类细胞因子IL-4等的表达水平,并采用简单直线相关分析上述转录因子和细胞因子间的相互关系。(2)动物实验研究中,首先,无菌分离培养Balb/c小鼠脾细胞,以ConA和CpG寡核苷酸刺激,诱导并提高脾细胞T-bet的mRNA丰度,利用RT-PCR方法克隆小鼠T-bet全长编码的cDNA,并连接到pGEM-T载体上,进行PCR、酶切和测序鉴定。其次,选取经测序验证序列正确的T-bet阳性质粒,双酶切获取T-bet全长基因片段,定向插入腺相关病毒表达质粒形成Pzac2.1-T-bet,其与pAddeltaF6及p5E18质粒一道,采用磷酸钙共沉淀法转染HEK293细胞,包装为携带T-bet基因的重组腺相关病毒(rAAV-T-bet),经过肝素琼脂糖亲和层析纯化和Milipore Amicon(R)Ultra-15 100K离心过滤装置浓缩、去盐,制备高滴度纯化的rAAV-T-bet,实时荧光定量PCR检测重组病毒的滴度,并应用于包括D2SC等多种细胞的体外转染,观察T-bet基因的表达情况。第三,以卵清蛋白(OVA)致敏和激发,诱导小鼠哮喘模型,经鼻应用rAAV-T-bet,感染模型小鼠气道内存在的APC、淋巴细胞、气道上皮细胞等,于OVA最后一次雾化激发24小时后,处死小鼠并取材,应用HE和PAS染色观察小鼠肺组织的病理学变化,计数支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数,Wriight-Giemsa染色分析其中细胞类型,分别应用RT-荧光定量PCR和western-blot方法检测小鼠肺组织T-bet、GATA-3和Foxp3的mRNA和蛋白表达水平,同时应用免疫组织化学方法观察上述转录因子蛋白的在肺组织的细胞表达水平,免疫荧光法检测小鼠脾脏单个核细胞T-bet的表达,ELISA测定BALF中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5,血清IgE、OVA特异性IgE及体液中B淋巴细胞刺激因子(Blys)水平等,进一步观察rAAV-T-bet转染对支气管哮喘的免疫调节作用。结果表明:(1)喘息性支气管炎患儿淋巴细胞表达T-bet、IFN-γ明显减少,而表达GATA-3、IL-4水平显著增高,存在以Th2细胞过度分化为特征的Th细胞亚群分化失衡;相关分析表明,喘息性支气管炎患儿PBMC表达的IFN-γ、IL-4分别与T-bet、GATA-3呈正相关,而细胞因子或转录因子间互为负相关。(2)成功克隆小鼠T-bet全长编码cDNA并构建了T-bet基因表达质粒Pzac2.1-T-bet,于HEK293细胞中包装成携带T-bet基因的rAAV-T-bet,经纯化、浓缩、去盐后,成功制备了高滴度的rAAV-T-bet,并在体外包括D2SC等多种细胞中获得有效转染。(3)在建立小鼠哮喘模型的基础上,经鼻应用rAAV-T-bet干预可成功传递T-bet基因,并对哮喘模型的免疫病理紊乱实现调控:首先,有效抑制了哮喘存在的Th2细胞因子IL-4、IL-5和转录因子GATA-3的优势表达,提升了Th1细胞因子IFN-γ及转录因子T-bet的水平;其次,显著抑制了肺组织炎症细胞浸润和粘液腺分泌,减少了BALF中EOS的数目,抑制了OVA诱导的EOS和淋巴细胞浸润性气道炎症;第三,检测发现,哮喘时CD4+CD25+Treg细胞特异性转录因子Foxp3的mRNA和蛋白表达水平明显下降,rAAV-T-bet干预后其相应水平获得明显提升。此外,rAAV-T-bet干预明显降低了B细胞产生IgE的能力,但增强了BLys和肺外T-bet的表达。由此得出以下结论:(1)婴幼儿喘息性支气管炎具有类似哮喘的免疫病理学改变,存在Th2细胞优势免疫应答的失衡,Th1/Th2细胞因子IFN-Y/IL-4的分泌失衡分别受到核转录因子T-bet/GATA-3的调控,在转录水平上,T-bet与GATA-3相互抑制。(2)成功构建了T-bet基因表达质粒Pzac2-1-T-bet,与pAddeltaF6及p5E18质粒共转染293细胞后,包装成携带T-bet基因的rAAV-T-bet,并成功转染了D2SC等细胞系,为开展T-bet转染的抗原提呈细胞的免疫调节作用、进行T-bet基因干预哮喘的实验研究奠定了基础。(3)经鼻应用rAAV-T-bet介导了小鼠T-bet基因对哮喘模型的免疫调节作用:增强Thl型免疫应答,抑制Th2型应答及气道过敏性炎症,在转录因子和细胞因子水平上调节了Th亚群失衡。(4)哮喘模型小鼠肺组织表达Foxp3减少,提示哮喘模型小鼠体内表达Foxp3的Treg细胞可能数目减少和分化障碍,存在诱导外周免疫耐受能力的减弱。rAAV-T-bet的干预,诱导了表达Foxp3的Treg细胞活性,增强了机体气道和肺部的免疫耐受,进一步调节Th1/Th2失衡,避免过度Th1型应答的发生。(5)rAAV-T-bet干预对B细胞也发挥间接调节作用。通过抑制Th2细胞功能,减少IL-4的分泌,明显降低B细胞产生IgE的能力,同样通过增强Th1应答,增加IFN-Y的生成进而升高BLys水平,加强B细胞作用。